Nach dem Einschalten des konfokalen Mikroskops, das mit 40x- und 63x-Ölimmersionsobjektiven ausgestattet ist, legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Um die mit der Flügelscheibe assoziierten Muskelvorläuferzellen und indirekten Flugmuskeln oder IFMs abzubilden, wird DAPI mit einer Anregung von 405 und einer Emission von 450 Nanometern eingestellt. Dann wählen Sie Alexa Fluor 488 mit einer Anregung von 496 und einer Emission von 519 Nanometern und Quasar 670 für die smFISH-Sonden mit einer Anregung von 647 und einer Emission von 670 Nanometern.
Lokalisieren Sie die Probe mit einem DAPI-Signal und einer UV-Lampe. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder als TIFF-Dateien. Um die adulten Muskelstammzellen abzubilden, stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen für DAPI und Alexa Fluor 488 ein, wie zuvor gezeigt.
Stellen Sie dann die Wellenlängen für Alexa Fluor 555 und Quasar 670 für die smFISH-Sonden ein. Suchen Sie das Beispiel, und speichern Sie die aufgenommenen Bilder im TIFF-Format. Starten Sie Bild J und navigieren Sie zum Plugin-Menü.
Wählen Sie Makros und dann Bearbeiten aus, um den Quellcode der Makros zu öffnen. Um Mef2 smFISH-Flecken in Larven zu quantifizieren, setzen Sie den Log-Radius auf drei und die Log-Qualität auf 20. Dann segmentieren Sie Mef2-positive Kerne mit einer Unschärfe von zwei, einem Kernskalenparameter von 30, einer Kernschwelle von minus acht und einer Kerngröße von 300.
Initiieren Sie das Makro, indem Sie den Befehl run ausführen. Das Makro lädt automatisch alle Bilder aus dem angegebenen Ordner und quantifiziert sie sequenziell. Stellen Sie in Muskelfasern den logarithmischen Radius auf 2,5, die logarithmische Qualität auf 60, die Unschärfe auf zwei, den Parameter für die Kernskala auf 100, den Kernschwellenwert auf Null und die Kerngröße auf 300 ein.
Initiieren Sie das Makro, indem Sie den Befehl run ausführen. Das Makro lädt automatisch alle Bilder aus dem angegebenen Ordner und quantifiziert sie sequenziell. Überprüfen Sie nach der Analyse die Ergebnisse, die in den Ergebnissen der Datei FISH und der Datei Nuclei angezeigt werden.
Die Mef2- und Zfh1-Transkripte wurden einheitlich in der AMP-Population detektiert und mit Mef2- bzw. Zfh1-Proteinen kolokalisiert. Eine höhere Vergrößerung der AMPs unterschied zwischen Transkriptionsstellenfoci und reifer mRNA, die im Zytoplasma verstreut ist. In ähnlicher Weise wurden die Transkriptionsstelle und die Verteilung von Mef2- und Zfh1-mRNA in differenzierten adulten IFMs und assoziierten Stammzellen untersucht.
Das eigens entwickelte Bild-J-Makro detektierte und segmentierte effektiv Mef2-Flecken und Muskelkerne. Die quantitative Analyse der Mef2-mRNA pro Zellkern in adulten IFMs und den AMPs unterschied sich nicht signifikant. Die Quantifizierung der Mef2-Spot-Verteilung zeigte, dass 92 % der Mef2-mRNA im Zytoplasma vorhanden sind und 8 % mit Muskelkernen assoziiert sind.
