Stellen Sie zunächst die Parameter der Pipettenstation in der Laminar-Flow-Haube auf 1.900 Volt, 20 Millisekunden in einem Impuls ein. Nehmen Sie vorsichtig ein Transfektionsröhrchen aus der Verpackung, um es steril zu halten, und füllen Sie es mit drei Millilitern E-Puffer. Um die Zellen auf die Elektroporation vorzubereiten, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen und waschen Sie sie mit PBS, um das Serum und zweiwertige Kationen zu entfernen, die die Adhäsion fördern.
Geben Sie dann eine Mischung aus PBS und einem millimolaren EDTA zu den Zellen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für etwa fünf Minuten, bis sich die Zellen abzulösen beginnen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu lösen und die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinbindung zu übertragen. Pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g.
Nach der Zentrifugation wird der größte Teil des Überstands schnell entfernt, wobei etwa ein Milliliter des Überstands im Röhrchen verbleibt. Resuspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Überstand und übertragen Sie ihn in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Entnehmen Sie ein kleines Aliquot von Zellen, um sie zu zählen, und pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifusion bei 500 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Zählen Sie die Zellen während der Zentrifugation. Nehmen Sie 1x sgRNA in 20 Millimolar Cas9-Lösung und erwärmen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der gesamte Überstand aus dem Zellpellet entfernt und die Zellen in PBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid in einer Konzentration von 40 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendiert.
Für die Assemblierung des sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexes werden 2,5 Mikroliter sgRNA zu einem Mikroliter des verdünnten Cas9 in sterilisierten PCR-Röhrchen gegeben und die sgRNA etwa 15 Sekunden lang langsam gemischt, um eine Ausfällung zu verhindern. Fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung des Ribonukleoproteinkomplexes zu ermöglichen. Um den Ribonukleoproteinkomplex durch Elektroporation zu verabreichen, bereiten Sie die Elektroporationsspitze vor, indem Sie den Kolben drücken, um den Stiel zu verlängern.
Stecken Sie dann den Stiel in die Spitze. Resuspendieren Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren. Beladen Sie die Elektroporationsspitze mit den Zellen und entnehmen Sie die volle Volumenkapazität von 10 Mikrolitern der Spitze.
Ausgehend von der Negativkontroll-sgRNA werden 10 Mikroliter Zellen in der Elektroporationsspitze in das Probenröhrchen mit 3,5 Mikrolitern Ribonukleoprotein übertragen. Pipettieren Sie dreimal nach oben und unten, um gut zu mischen, und ziehen Sie 10 Mikroliter der Mischung zurück in die Spitze. Setzen Sie die Spitze in die Elektroporationsstation ein, senken Sie sie in den Puffer und drücken Sie Start auf dem Touchscreen-Display.
Nach Beendigung des Vorgangs zeigt das Display einen erfolgreichen Impuls an. Nehmen Sie die Pipette aus dem Gerät und legen Sie die Zellen in eine trockene Vertiefung der unbeschichteten 12-Well-Platte. Spülen Sie die Spitze ab, indem Sie zweimal 15 Milliliter PBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid auf und ab pipettieren.
Legen Sie die Pipette beiseite, während die Spitze noch befestigt ist. Geben Sie sofort einen Milliliter des zuvor aliquotierten antibiotikafreien Mediums zu den Zellen und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sie zu mischen. Das repräsentative Sanger-Sequenzierungschromatogramm des Rosa-26-Locus aus den aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen, die mit einem kontrollierten, nicht-zielgerichteten sgRNA-Cas9-Ribonukleoprotein, Rosa-26-spezifischer sgRNA und den Src- und Cblb-Genen in den editierten Makrophagen elektroporiert wurden, ist hier dargestellt.
Die Analyse der Zielgene mittels PCR und Sanger-Sequenzierung zeigt mehrere Nukleotide an jeder Position stromabwärts der Cas9-Spaltstelle. Diese Ergebnisse bestätigen das Erreichen einer hohen Editierungseffizienz für mehrere Zielgene.
