1 2 Sehen Sie sich zunächst die HEK 293T-Zellen3 24 Stunden vor der Transfektion 4 in einer 15-Zentimeter-Schale an, die GMEN enthält. 5 Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius 6 und 5 % Kohlendioxid 7, bis sie eine Konfluenz von 40 bis 50 % erreichen. 8 Beschriften Sie drei 15-Milliliter-Plastikröhrchen 9 mit dem entsprechenden Lentivirus-Namen.
10 Geben Sie 1,710 Milliliter reduziertes Serummedium, 11 und 90 Mikroliter Transfektionsreagenz in jedes Röhrchen. 12 Mischen Sie den Inhalt, indem Sie 13 vortexen, bevor Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur inkubieren. 14 Nach fünf Minuten wird die Verpackungsvektormischung 15 zu dem Transfektionsmedium und dem Wirbel gegeben.
16 Dann füge ich 7,5 Mikrogramm des Reprogrammierungsvektors 17 und der pWPT-GFP-Kontrolle 18 zu der jeweiligen Transfektionsmischung hinzu. 19 Die Röhrchen zwei Sekunden lang 20 vortexen, bevor sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. 21 Um die 293T-Zellen mit jedem Lentivirus 22 tropfenweise zu transfizieren, geben Sie eine Transfektions-DNA-Mischung in die Schale.
23 Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius 24 und 5 % Kohlendioxid. 25 Nach 14 bis 16 Stunden 26 das Medium durch 30 Milliliter 27 frisches 293T Medium 28 ersetzen und die Inkubation für 60 bis 72 Stunden fortsetzen. 29 Beobachten Sie die Zellen täglich 30 und überprüfen Sie die Wirksamkeit der Transfektion.
31 Als nächstes wird die Virustransfektionskultur 32 in 15-Milliliter-Röhrchen 33 überführt und bei 1.932 G für 10 Minuten 34 bei vier Grad Celsius heruntergeschleudert. 35 Filtrieren Sie den lentiviralen Überstand 36 unter Verwendung eines 0,45-Mikron-Spritzenfilters 37 in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. 38 Einen Tag vor der Lentivirus-Transduktion 39 bereiten zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte 40 vor, die 100.000 PDAC-Zellen pro Vertiefung enthält.
41 Zwei 15-Milliliter-Röhrchen 42 mit zwei Millilitern vorgewärmtem PDAC-Medium vorbereiten. 43 In das erste Röhrchen 44 fügen Sie 12 Milliliter reprogrammierendes Lentivirus hinzu. 45 Dann 12 Mikroliter Polybrene 46 hinzufügen und durch Pipettieren mischen.
47 In das zweite Röhrchen 48 füge ich zwei Mikroliter Polybren hinzu. 49 Entnehmen Sie nun vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung 50 einer 6-Well-Platte 51 und waschen Sie es einmal mit PBS bei Raumtemperatur. 52 Geben Sie das Reprogrammierungsinfektionsmedium 53 aus dem ersten Rohr in die erste Vertiefung.
54 Gib die Mischung aus der zweiten Tube in die zweite Vertiefung. 55 Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius 56 mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff. Am nächsten Tag wird das Medium 58 aus beiden Vertiefungen durch frisches PDAC-Medium 59 ersetzt und die Inkubation 60 wie gezeigt bis zu 48 Stunden lang fortgesetzt.
