Präparation von iMEF-Feederzellen und Reprogrammierungstransduktion für induzierte pluripotente Stammzellen

1 Beschichten Sie zunächst die 6-Well-Platte2 mit zwei Millilitern 0,2%iger Gelatinelösung pro Well. 3 Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius 4 und 5 % Kohlendioxid. 5 Geben Sie anschließend tropfenweise iMEFs in ein 15-Milliliter-Röhrchen 6, das 10 Milliliter 7 vorgewärmtes humanes Fibroblastenmedium enthält, 8 und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.

9 Die Zellsuspension wird drei Minuten lang bei 309 g zentrifugiert. 10 Und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet 11 in 12 Millilitern humanem Fibroblastenmedium resuspendieren. 12 Geben Sie zwei Milliliter der Zellsuspension 13 in jede Vertiefung der mit Gelatine beschichteten Sechs-Well-Platte.

14 Und über Nacht bei 37 Grad Celsius 15 und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 16 Entsorgen Sie das Medium des Lentivirus-infizierten 17 und des nicht infizierten PDAC und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. 18 Fügen Sie dann 500 Mikroliter Trypsin hinzu, um die Zellen zu dissoziieren.

19 Und inkubieren bei 37 Grad Celsius 20 mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff 21 für 15 Minuten. 22 Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. 23 Und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter PDAC-Medium.

24 Waschen Sie die iMEF-Platte mit PDAC-Medium. 25 Geben Sie dann 50.000 Lentivirus-infizierte PDAC-Zellen 26 pro Vertiefung in fünf Vertiefungen der iMEF-Platte und inkubieren Sie über Nacht 27, wie zuvor gezeigt. 28 Nach der Vorbereitung des Reprogrammierungsmediums 29 fügen Sie 100 Mikroliter basische Fibroblasten, Wachstumsfaktor, 30 bis 100 Milliliter Reprogrammierungsmedium hinzu.

31 Waschen Sie am nächsten Tag die auf iMEF-Feedern wachsenden Zellen zweimal 32 mit vorgewärmten Reprogrammierungsmedien. 33 Dann geben Sie zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung, 34 und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius 35 mit 5 % Kohlendioxid und 3 % Sauerstoff. 36 Nachdem sie den IPSC-Pool fünfmal passiert haben, beobachten 37 die robusten Kolonien 38, die eine ESC-ähnliche Morphologie beibehalten.

39 Der PDAC, BxPc3, 40 H6c7 und der humane Fibroblast 41 zeigten unterschiedliche Tage der Reprogrammierung 42 zur Bildung einer reifen ESC-ähnlichen Morphologie. Es wurden 43 klonale IPSC-Linien etabliert 44 aus jeder Reprogrammierung von PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 und humanen Fibroblastenzellen. 47 Alle etablierten IPSC-Linien färbten sich positiv 48 für TRA-160, was ihre Reprogrammierung zur Pluripotenz bestätigt.