Gießen Sie zunächst 100 Milliliter destilliertes Wasser in ein Becherglas, das 4 Gramm Zucker und 0,8 Gramm Agar enthält. Die Mischung unter ständigem Rühren auf 100 Grad Celsius erhitzen. Nimm die Mischung vom Herd, um sie abzukühlen.
Verringern Sie die Hitze, um eine Temperatur von 80 Grad Celsius zu halten. Dann 7,4 Gramm Mehl und 2,8 Gramm Hefe unter Rühren in die Mischung geben. Als nächstes die Moldex Propionsäurelösung in die Mischung geben und dann die Temperatur auf 50 Grad Celsius abkühlen.
Fügen Sie die Psidium-Guayava-Pflanzenextraktlösung hinzu, gefolgt von 0,5 Gramm Bromphenolblaupulver. Gießen Sie die zubereitete Speisenmischung in Petrischalen, bis jede Schale voll ist. Nachdem das Geschirr auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, verschließen Sie es mit den Deckeln und lagern Sie es im Kühlschrank bei 4 Grad Celsius.
Um die Fläschchen für den Test vorzubereiten, bereiten Sie zunächst die Kohlendioxidtanks, die Kohlendioxid-Blaspistole mit Nadeln, das Fliegenkissen, den Pinsel und das Mikroskop für den Umgang mit den Fliegen vor. Wählen Sie Fläschchen mit mindestens 10 Drosophila-Puppen aus, um das Alter der Fliegen zu standardisieren. Um die erwachsenen Fliegen zu entfernen, drehen Sie die Fläschchen um und führen Sie eine Nadel zwischen den Wattestopfen und die Seitenwand des Fläschchens ein.
Betäuben Sie die erwachsenen Fliegen mit der Kohlendioxid-Blaspistole, bis sie bewusstlos auf dem Wattestöpsel sitzen. Öffnen Sie das Fläschchen über einer Glasflasche mit 70%igem Ethanol und lassen Sie die Fliegen hineinfallen. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit dem Wattestopfen.
Inkubieren Sie es dann bei 25 Grad Celsius mit 60 % Luftfeuchtigkeit und einem Lichtzyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. Als nächstes werden die Fliegen mit Hilfe eines Mikroskops innerhalb von acht Stunden nach der Inkubation in jungfräuliche Weibchen und Männchen sortiert, um eine Paarung zu verhindern. Die weiblichen Genitalien sind an ihrer blassen Farbe zu erkennen, während die männlichen Genitalien einen rötlichen Farbton haben.
Männchen erkennt man auch an den Geschlechtskämmen an den Vorderbeinen. Teilen Sie die sortierten Fliegen in zwei frische Röhrchen, eines für jedes Geschlecht, und brüten Sie sie 6-8 Tage lang bei 25 Grad Celsius aus. Beginnen Sie damit, beschriftete Petrischalen übereinander zu stapeln.
Drehen Sie die Petrischalen mit den gefärbten Lebensmitteln auf Löschpapier um, um überschüssige Flüssigkeit aufzusaugen. Verwenden Sie dann einen Spatel, um das Essen in jedem Gericht in 12 gleiche Segmente zu teilen. Geben Sie eine Scheibe Essen in eine leere Petrischale.
Als nächstes betäubst du die Fliegen mit Kohlendioxid, bis sie auf dem Wattestöpsel schlafen. Geben Sie vorsichtig sechs gesunde Fliegen in jede Petrischale. Stellen Sie die verschlossenen Schalen in einen Inkubator.
Um zu verhindern, dass die Fliegen während des Experiments entkommen, befestigen Sie die obere und untere Abdeckung jeder Petrischale mit Klebeband. Nach einer Aufzuchtzeit von 24 Stunden werden die Fliegen erneut mit Kohlendioxid betäubt. Füllen Sie dann die Fliegen zur Entsorgung in einen mit 70 % Ethanol gefüllten Behälter um.
Entsorgen Sie auch alle Essensreste aus dem Geschirr. Um die Quantifizierung der Petrischalen zu erleichtern, starten Sie die Epson Scan 2-Software, vergeben Sie einen Dateinamen und führen Sie einen Vorschau-Scan durch. Scannen Sie sowohl die obere als auch die untere Abdeckung jeder Petrischale einzeln.
Schneiden Sie den Scan mit einem Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm sorgfältig auf Bilder zu, um Artefakte und Essensreste zu entfernen, und speichern Sie das zugeschnittene Bild dann als TIFF-Datei. Starten Sie als Nächstes die T.U.R.D.-Software. Klicken Sie auf Datei, um ein neues Versuchsdokument zu erstellen, ihm einen Namen zuzuweisen und es im Unterordner Analyse zu speichern.
Klicken Sie auf die Option Platten und wählen Sie dann Platte hinzufügen, um die Petrischale für die Analyse auszuwählen. Es erscheint ein neues Fenster, in dem die Namen der ausgewählten Platten zusammen mit den neuen Parametereinstellungen angezeigt werden. Legen Sie die Blockgröße auf 21, den Offset auf 5, die Mindestgröße auf 20 und die Maximalgröße auf 600 fest.
Um die Genauigkeit der Erkennung von Fäkalablagerungen zu überprüfen, navigieren Sie zu Platten und klicken Sie dann auf Ausgewählte Platten prüfen, gefolgt von Grafiken und Kommentierte Bilder anzeigen. Zoomen Sie in die Bilder, um die Anzahl der Einzahlungen zu überprüfen. Heben Sie ggf. die Auswahl von Ablagerungen auf, die nicht in die Analyse einbezogen werden sollen.
Passen Sie nach der Analyse mit der T.U.R.D.-Software die Anzahl der Fliegen an, indem Sie auf die Anzahl der Fliegen klicken. Ändern Sie den Gruppennamen, indem Sie auf Platten und dann auf Gruppen bearbeiten klicken und dann auf Hinzufügen klicken. Wählen Sie in der Spalte Gruppe den entsprechenden Gruppennamen aus.
Klicken Sie anschließend auf Analysieren, gefolgt von Deskriptive Statistik und wählen Sie Gruppe aus, um die Daten für jedes Replikat separat zu exportieren. Speichern Sie alle resultierenden Tabellenkalkulationsdateien im selben Ordner. Um alle Daten in einer einzigen Tabelle zusammenzufassen, öffnen Sie die Anwendung Excel Merge v4.
Wenn Sie aufgefordert werden, den Pfad des Ordners mit CSV-Dateien auszuwählen, geben Sie die Ordneradresse ein und drücken Sie zweimal die Eingabetaste, um eine neue Tabelle im selben Ordner zu erstellen. Fügen Sie der Tabelle ein neues Blatt mit den zusammengeführten Daten hinzu, um den Mittelwert der einzelnen Parameter für alle Replikate zu berechnen. Verwenden Sie die SVERWEIS-Funktion, um den Mittelwert der einzelnen Parameter aller Replikate zu erfassen.
Starten Sie die GraphPad Prism-Software und geben Sie die Datensatznamen ein. Übertragen Sie die Daten aus der Excel-Tabelle in das Prism-Datendiagramm. Klicken Sie auf Analysieren, um die zu analysierenden Datensätze auszuwählen, und drücken Sie OK. Wählen Sie die geeigneten Testparameter, analysieren Sie den p-Wert.
Die Anzahl der fäkalen Ablagerungen, die Gesamtfläche der Ablagerungen und der IOD waren in der normalen Lebensmittelgruppe im Vergleich zum P.guajava-Extrakt sowohl bei jungfräulichen Männern als auch bei Frauen signifikant höher. Die Nachverfolgung des Verzehrs von fester Nahrung zeigte, dass es keine signifikanten Unterschiede in der Nahrungsaufnahme zwischen den verabreichten und den nicht medikamentös verabreichten Gruppen gab. Die männlichen Fliegen, die Loperamid konsumierten, schienen jedoch weniger Nahrung aufzunehmen als normalerweise.
