Verwenden Sie zunächst eine 25-Mikroliter-Hamilton-Spritze, um betäubten Rattenwelpen 15 Mikroliter Addgene intraperitoneal zu injizieren. Rasieren Sie als Nächstes die Haare und Schnurrhaare von betäubten sechs bis acht Wochen alten Welpen. Montieren Sie die Ratte auf einem stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln.
Und legen Sie ein Heizkissen darunter, um die Körpertemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten. Als nächstes wird die Gaze in eiskalte Kochsalzlösung auf den Kopf der Ratte getaucht, um die Blutung zu minimieren. Machen Sie mit einem Skalpell der Größe 15 einen Schnitt an der Mittellinie der Haut und des Muskels über dem Schädel.
Ziehe die Haut und den Muskel weg, um den Schädel freizulegen. Perforieren Sie mit einem eins mal vier runden Bohrer vorsichtig die Schädeldecke, um das Vorderhirn freizulegen. Schneide dann mit Rongeuren durch den Schädel.
Machen Sie mit einem Skalpell der Größe 15 einen Schnitt im Gehirn und im Riechkolben. Verwende einen Spatel, um die Dura vorsichtig vom Schädel zu trennen. Heben Sie dann das durchtrennte Gehirn vorsichtig an, um das Trigeminusganglion und die Schädelbasis sichtbar zu machen.
Kauterisieren Sie jede Blutung mit einem Kauterstift. Um den GCaMP6-X abzubilden, platzieren Sie die Schädelhöhle unter dem Objektiv des Mikroskops. Bringen Sie dann das terminale Ganglion in den Fokus.
Wenden Sie dann mechanische Reize auf einen Quadratzentimeter des Gesichts an. Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um die Neuronen des Trigeminusganglions zu visualisieren, die auf den Reiz reagieren. Um die fluoreszierende Stato im Zeitverlauf mit der Erfassungssoftware zu erfassen, drücken Sie die Stream-Erfassungstaste im Erfassungsmenü.
Stellen Sie dann die Anzahl der Frames auf 300 und die Aufnahmezeit auf 90 Sekunden ein. Legen Sie die Kameraparameter fest, um Bilder mit Bildrate aufzunehmen. Erhalten Sie stabile Baseline-Aufzeichnungen über einen Zeitraum von drei Minuten.
Ein größeres Volumen an Virustiter führte zu einer erhöhten neuronalen Infektion der Rattenjungtiere. Die leichte mechanische Stimulation aktivierte nur die V2-Region des Trigeminusganglions. Die Fluoreszenz im Ruhezustand war in den meisten Neuronen relativ niedrig mit wenigen spontanen Anstiegen.
Natürliche Reize, insbesondere die punktuelle Stimulation, lösten die robustesten neuronalen Reaktionen aus. Bürstenstimuli in chronischen Engpassmodellen führten zu einer Verdoppelung der Spitzenreaktion des Verletzten im Vergleich zur kontralateralen Seite. Wenn zwei Stimuli nacheinander angewendet wurden, gab es eine signifikante Verstärkung als Reaktion auf den zweiten Stimulus.
