Isolieren Sie zunächst den linken Vorhof und die Lungenvenen oder PVs vom Herzen der Maus. Legen Sie das isolierte Gewebe mit der Herzbasis und der Lungenspitze nach oben in ein Kryomol. Entwirren und entwirren Sie die PVs, falls sie gewunden sind.
Füllen Sie dann das Kryomold mit der OCT-Verbindung. Wenden Sie mit einer feinen Pinzette eine sanfte Kompression auf die PVs an, ohne sie zu bewegen, um Restluft zu entfernen. Frieren Sie das Gewebe in der OCT-Verbindung auf Trockeneis ein.
Für die Immunfärbung werden die gefrorenen PV-Objektträger der Maus 20 Minuten lang auf einem Färbesystem aufgetaut. Geben Sie dann einige Tropfen einer 4%igen Paraformaldehyd-Fixierlösung auf die Abschnitte, um das Gewebe auf dem Objektträger zu befestigen. Nach der Inkubation werden die Objektträger in ein vertikales Gestell gebracht und in einen mit PBS gefüllten Behälter getaucht.
Stellen Sie den Behälter fünf Minuten lang auf einen langsamen Schüttler, um die Objektträger zu spülen. Verwenden Sie einen Flüssigblocker-Stift, der Xylol enthält, und kreisen Sie jeden Abschnitt auf jeder Folie ein. Und ordnen Sie die Objektträger auf dem Färbesystem neu an.
Tragen Sie mit einer Pasteurpipette ein oder zwei Tropfen Permeabilisationslösung auf jede Probe auf. Reinigen Sie dann die Triton X-100-Lösung, indem Sie die Objektträger fünf Minuten lang in PBS waschen. Nachdem Sie die Objektträger auf dem Färbesystem neu angeordnet haben, geben Sie ein oder zwei Tropfen des Blockierungspuffers in jeden Abschnitt, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten.
Als nächstes bereiten Sie einen Milliliter der primären Antikörpermischung vor, die aus den primären Antikörpern und dem blockierenden Puffer besteht. Verwerfen Sie den übrig gebliebenen blockierenden Puffer von der Folie. Verabreichen Sie zwei oder drei Tropfen der primären Antikörpermischung an jeden Abschnitt.
Legen Sie die Objektträger nach der Inkubation in ein vertikales Gestell und spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in Waschpuffer unter sanftem Rühren. Bereiten Sie dann einen Milliliter der sekundären Antikörpermischung vor, die aus den sekundären Antikörpern und dem Waschpuffer besteht. Positionieren Sie die Objektträger wieder auf dem Färbesystem und geben Sie mit einer Pipette zwei oder drei Tropfen der sekundären Antikörpermischung auf jeden Abschnitt.
Anschließend die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten im Waschpuffer unter Schütteln reinigen. Geben Sie dann zwei oder drei Tropfen der Hoechst 33342-Lösung in jeden Abschnitt, der auf dem Färbesystem angeordnet ist. Legen Sie die Objektträger in ein vertikales Gestell und spülen Sie sie fünf Minuten lang in einem Waschpuffer unter leichtem Rühren.
Geben Sie ein oder zwei Tropfen fluoreszierendes Eindeckmedium in jeden Objektträger und versiegeln Sie die Objektträger mit Deckgläsern. Die Pulmonalvenenöffnungsregion am linken Vorhof und an der Pulmonalvenenverbindung, extrapulmonale Venen und interpulmonale Venen wurden unter 10-facher Vergrößerung beobachtet. Spezifische cTnT-Signale mit einer typischen Muskelstreifung in der Pulmonalvenenöffnung, extrapulmonalen Venen und intrapulmonalen Venen wurden bei 40-facher Vergrößerung beobachtet.
Cx43 wurde in allen drei Lungenregionen gefunden und hauptsächlich zwischen benachbarten Kardiomyozyten projiziert. Cx43-bezogene Signale wurden auf der polaren Seite und der lateralen Seite der Kardiomyozyten in den Myokardhülsen beobachtet.
