Nehmen Sie zunächst Pseudomonas aeruginosa-Kulturen, die 24 Stunden lang gezüchtet werden. Stellen Sie dann die optische Dichte von 600 Nanometern auf 0,2 ein und nehmen Sie geeignete Verdünnungen mit 0,8%iger Kochsalzlösung vor. Mit einer sterilen Drahtschlaufe die Bakterienkultur auf die CAS-Agarplatte streichen.
Inkubieren Sie die CAS-Agarplatte 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Übertragen Sie die Kultur auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern. Als nächstes werden die Kulturen in Zentrifugenröhrchen überführt.
Die Bakterienkultur wird bei 4650 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Pipettieren Sie 100 Mikroliter des zellfreien Überstandes und geben Sie ihn in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte. Geben Sie dann 100 Mikroliter CAS-Farbstoff in die Vertiefung.
Decken Sie die Platte vor der Inkubation mit Aluminiumfolie ab. Nach der Inkubation werden spektralphotometrische Messungen bei 630 Nanometern durchgeführt und die Gesamtmenge der Siderophore als prozentuale Siderophoreinheit berechnet. Pipettieren Sie 100 Mikroliter des zellfreien Überstandes in eine 96-Well-Mikrotiterplatte.
Dann 100 Mikroliter Trissalzsäure hinzugeben. Messen Sie den spektralphotometrischen Messwert der Lösung bei 405 Nanometern. Für die Pyochelin-Extraktion werden zunächst 100 Milliliter 48 Stunden lang gezüchtete Kulturen von Pseudomonas aeruginosa in Zentrifugenröhrchen pipettiert.
Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4650 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes geben Sie fünf Milliliter einer molaren Zitronensäure in den Überstand. Geben Sie 50 Milliliter Ethylacetat in die Lösung, um Pyochelin zu extrahieren.
Die organische Phase mit Magnesiumsulfat durch einen Spritzenvorsatzfilter filtrieren. Anschließend die organische Phase bei minus 20 Grad Celsius lagern. Zum Schluss nehmen Sie spektralphotometrische Messungen bei 320 Nanometern vor.
Die drei klinischen Isolate und der Referenzstamm PAO1 entwickelten einen klaren orangefarbenen Halo, wenn sie auf CAS-Agar gezüchtet wurden, was auf die Siderophorproduktion hinweist. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen der gesamten Siderophorproduktion des J3-Isolats und PAO1 beobachtet. Spektrophotometrische Analysen des Pyoverdin-Extrakts zeigten einen bestätigenden Peak bei 380 Nanometern.
Während alle Isolate positiv für die Pyoverdin-Produktion waren, zeigten MR1 und J3 eine geringere Produktion im Vergleich zum Referenzstamm. Das Vorhandensein von Pyochelin wurde durch einen Peak bei 320 Nanometern bestätigt. Alle drei klinischen Isolate produzierten signifikant höhere Volumina im Vergleich zu PAO1.
