Beginnen Sie mit der Vorbereitung der gesamten Fassung der festen Linse, indem Sie Immobilisierungs-Agarose-Keile erstellen. Nehmen Sie dazu eine Schale mit Glasboden und gießen Sie etwa fünf bis sechs Milliliter geschmolzene 2%ige Agarose in PBS hinein. Warten Sie, bis die Agarose fest geworden ist.
Verwenden Sie dann eine scharfe Klinge, um ein dreieckiges Divot in der erstarrten Agarose zu erzeugen. Entfernen Sie die Agarosespalte und geben Sie einen Milliliter PBS in die Schüssel. Agarosereste, die nach dem Schneiden zurückbleiben, absaugen.
Erstellen Sie mehrere Wedges in einer einzigen Schale, um bei Bedarf mehrere Linsen unterzubringen. Um die Form zu lagern, geben Sie einen Milliliter PBS hinein, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius halten. Setzen Sie die Linse mit einer gebogenen Pinzette in den Agarosekeil ein, der einen Milliliter PBS enthält.
Stellen Sie das Objektiv so ein, dass der Äquatorbereich nach unten auf das Mikroskopglas zeigt, wenn es über dem konfokalen Objektiv platziert wird. Stellen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch. Um zu bestätigen, dass sich die Äquatorregion im Fokus befindet, visualisieren Sie die Kerne und stellen Sie sicher, dass sie in Reihen ausgerichtet sind.
Überprüfen Sie auch die unregelmäßig gepackten und geformten äquatorialen Epithelzellen und die präzise ausgerichteten und sechseckigen meridionalen Reihenzellen, die durch F-Aktin-Färbung an den Zellmembranen angezeigt werden. Eine zufällige Packung der Kerne im Gesichtsfeld zeigt an, dass die Linse dem Objektiv nach vorne zeigt. Wenn Kerne nicht beobachtet werden können, deutet dies wahrscheinlich darauf hin, dass die hintere Seite der Linse dem Objektiv zugewandt ist.
Verwenden Sie in solchen Fällen eine gebogene Pinzette, um die Linse zu drehen, bis die genau ausgerichteten Kerne am Linsenäquator beobachtet werden.
