Nachdem die vom Patienten abgeleiteten Magenorganoide für die Verpackung bereit sind, beginnen Sie mit der routinemäßigen Passage der Organoide. Entfernen Sie zunächst das Medium aus jeder Vertiefung, die die Organoide enthält, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind, in der 24-Well-Platte. Geben Sie dann einen Milliliter eiskaltes, fortschrittliches DMEM F12-Medium direkt auf eine Basalmembran-Matrixkuppel ab.
Saugen und dosieren Sie das Medium weiter, bis sich alle Fragmente der Kuppel von der Platte gelöst haben. Transportieren Sie dann sowohl das Medium als auch die fragmentierte Basalmembranmatrix vom Well zum nächsten Well und wiederholen Sie den Vorgang für alle Wells, die verpackt werden sollen. Nach der Demontage der letzten Basalmembran-Matrixkuppel geben Sie das Medium und die Mischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Befestigen Sie eine 1000-Mikroliter-Spitze an einer P1000-Pipette und führen Sie diese Spitze dann in eine 200-Mikroliter-Spitze ein. Mit diesem Pipettenaufbau wird die Organoidmatrixmischung etwa 25 Mal kräftig auf und ab pipettiert, um die Organoide in kleine Stücke zu fragmentieren. Zentrifugieren Sie das fragmentierte Organoidgemisch mit einer Tischzentrifuge bei vier Grad Celsius für 30 Sekunden bei 2000 G. Mit einer Pipette saugen Sie das Medium und den Überstand der Basalmembranmatrix ab.
Das berechnete Volumen der frischen Basalmembranmatrix wird zu den pelletierten Organoiden im Röhrchen gegeben. Pirigieren Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig auf und ab, um ihn zu mischen. Schnell aliquot, 50 Mikroliter der Organoid-Matrix-Mischung in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
Decken Sie den Teller sofort ab und drehen Sie den Teller in einer einzigen sanften Bewegung auf den Kopf. Legen Sie die invertierte Platte für 35 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann. Zum Schluss fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes Magenorganoid-Medium in jede Vertiefung hinzu.
Am 20. Tag nach der Initiation waren die Organoide bereit für die Passage, was durch eine große Organoidgröße oder ein abgedunkeltes Inneres angezeigt wurde. Organoide, die über diese Punkte hinausgingen, begannen, in 2D-Monoschichten zu zerfallen. Nach dem Verpacken und erneuten Aussaat enthielten die Kuppeln viele Organoidfragmente, die sich sehr schnell zu viel mehr Organoiden reorganisierten.
