Analysieren Sie das Antikörperpanel und vergewissern Sie sich, dass das Zytometer über mindestens vier Laser verfügt, darunter rote, gelbe, blaue und violette. Richten Sie die Kompensationsmatrix entweder mit Kompensationskügelchen oder mit einzelnen Färbezellenkontrollen ein. Zur Kalibrierung und Standardisierung lassen Sie zu Beginn jedes Experiments Regenbogenfluoreszenzperlen laufen, indem Sie die Spannung der Photomultiplier-Röhre anpassen, bis die Spitzen der Kügelchen mit den Zielwerten aus den vorherigen Experimenten übereinstimmen.
Stellen Sie die Spannung und Verstärkung der Photomultiplier-Röhre für das Experiment ein. Verwenden Sie dann Antikörper-eingefangene Kompensationskügelchen, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen. Zeichnen Sie als Nächstes die seitliche Streufläche auf log im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe linear in einem Punktdiagramm auf, blenden Sie Trümmer aus und wählen Sie die Zellengröße mit dem S1-Gatter aus, wählen Sie Singulett-Zellen in einem Punktdiagramm eine Vorwärtsstreubreite im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe mit S2-Gatter.
Verwenden Sie für die Einrichtung von Gates der vierten Etage die entsprechende FMO für jedes vierkanalige Stockwerk. Mit Einzelparameter-Histogrammen wird das positive Signal in jedem Kanal ermittelt und die Gates entsprechend festgelegt. Zeichnen Sie die Proben sorgfältig mit der etablierten Anschnittstrategie auf.
Identifizierung von Mikroglia mit Hilfe des P2 RY 12 plus-Signals und Bestimmung der Proteinexpression im jeweiligen Kanal nur für Mikroglia. Richten Sie Analyse-Gates auf der Benutzeroberfläche der Zytometer-Analysesoftware ein, indem Sie die gleiche Gating-Strategie replizieren, die während der Aufzeichnung verwendet wurde. Verwenden Sie die Funktion zum Hinzufügen von Statistiken, um den Median für die interessierende Grundgesamtheit auf der kompensierten Kanalhöhe auszuwählen.
Exportieren Sie die MFI-Werte für die jeweiligen Kanäle mit dem Tabelleneditor in eine Tabelle, um weitere statistische Analysen durchzuführen. Die Behandlung mit Lipopolysaccharid induzierte einen Anstieg der Histon-3-Lysin-27-Acetylierung. Wenn der MFI innerhalb des Geschlechts normalisiert ist, zeigte die Histogrammanalyse der gefärbten Zellen normal verteilte Populationen mit Zellverschiebungen zu erhöhter Fluoreszenz.
Ein ähnlicher Anstieg der Histon-3-Lysin-27-Acetylierung wurde in den gefärbten Zellen beobachtet.
