Waschen Sie die oben behandelten Zellen mit eiskaltem PBS, um alle Restmedien zu entfernen, und fügen Sie 50 Mikroliter des PMSF-haltigen RIPA-Lysepuffers hinzu, um die Zellen zu lysieren. Sammeln Sie die Zellen in einem Röhrchen. Die Zellen werden einige Minuten lang auf Eis inkubiert, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, und dann 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 g zentrifugiert.
Dann wird das Zelllysat mit einem Ladepuffer gemischt und die Mischung bei 95 bis 100 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten auf einem Wasserbad erhitzt, um die Proteine zu denaturieren. Laden Sie 10 Mikroliter Gesamtprotein aus jeder Probe auf ein SDS0-PAGE-Gel. Lassen Sie das Gel unter einer konstanten Spannung von 80 Volt laufen.
Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn das Bromphenolblau den Boden des Trenngels erreicht. Anschließend werden die abgetrennten Proteine aus dem Gel mit einem Nasstransfersystem in einem Eisbad auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran übertragen. Nach Abschluss des Transfers wird die Membran entfernt und die Membran etwa eine Stunde lang in einem Blockierungspuffer bei Raumtemperatur inkubiert.
Inkubieren Sie die Membran mit einem sekundären Antikörper, der an HRP konjugiert ist. Visualisieren Sie die Proteinbanden auf der Membran mit einem Chemilumineszenzsubstrat und erfassen Sie das Signal mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die unterdrückte Expression von FAM83A die Proteine Bax und Cleaved-Caspase-3 erhöhte, die Expression von BCL-2 verringerte und die Freisetzung von Cytochrom c erhöhte.
