Bereiten Sie Einbettungsformen vor, indem Sie für jede Probe zylindrische Zinnfolien erstellen. Füllen Sie die Formen mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Masse. Bereiten Sie dann zwei Isolierfässer vor.
Füllen Sie das kleine Fass mit Isopentan und das große Fass mit flüssigem Stickstoff. Platzieren Sie das kleine Fass 10 Minuten vor der Muskeldissektion in das größere. Bereiten Sie zunächst die Maus für das Sezieren vor.
Schneiden Sie die Haut im Gesicht der Maus auf, um den Kaumuskel freizulegen. Entfernen Sie die Ohrspeicheldrüsen, um den hinteren Teil des Kaumuskels vollständig freizulegen. Präparieren Sie den Kaumuskel von seinem vorderen Ansatz bis zu seinem hinteren Ansatz am Unterkiefer.
Tauchen Sie dann das Muskelgewebe in OCT ein und halten Sie es senkrecht zur Verbindung. Übertragen Sie die Form mit einem Nadelhalter in das vorgekühlte Isopentan. Warten Sie 40 Sekunden, bis das OCT weiß und durchgehend wird.
Bewahren Sie die frischen, gefrorenen Muskelproben in beschrifteten 24-Well-Platten auf. Schneiden Sie die Proben sofort bei 20 Grad Celsius oder lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius für den Langzeitgebrauch. Schneiden Sie anschließend die Haut vom Knöchel bis zum Knie auf und entfernen Sie die Faszie, um den vorderen Musculus tibialis freizulegen.
Isolieren Sie mit der Spitze der Mikrodissektionezange die Sehne des Tibialis anterior und schieben Sie sie bis zum Knie, um die Fasern abzubrechen, die an der Tibia befestigt sind. Schneide die Sehne am Knöchel durch. Die HE- und Sirius-Rot-Färbung zeigte, dass der vordere Tibialis-Muskel nach 14 Tagen eine vollständige Regeneration mit einer ähnlichen Morphologie wie bei der intakten Kontrolle zeigte.
Im Gegensatz dazu zeigte der Kaumuskel nach 14 Tagen Frostverletzung eine gestörte Myofaserregeneration und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix. Die immunhistologische Färbung von Pax7 nach 14-tägiger Schädigung zeigte dicht besiedelte Zellkerne, jedoch ohne proportional erhöhte Muskelsatellitenzellen. 14 Tage nach der Verletzung wurde eine große Anzahl zentral gelegener Myofasern im vorderen Tibialis-Muskel nachgewiesen, während die Kontur der Myofasern im Kaumuskel im verletzten Bereich kaum wahrnehmbar war.
Stattdessen wurde die Infiltration von PDGFRalpha-positiven FAPs beobachtet.
