Immunfluoreszenzfärbung und hochauflösende konfokale Mikroskopie von CRISPR/Cas9-vermittelten CENP-E-Knockout-HeLa-Zellen

Nehmen Sie zunächst einen Teller mit Wildtyp- und CENP-E-mutierten HeLa-Zellen, die auf einem Deckglas wachsen. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd und PBS-Fixierlösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Tauchen Sie dann für zwei Runden von jeweils fünf Minuten in PBS ein.

Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25% Triton X-100 und PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Tauchen Sie sie für zwei Runden von jeweils fünf Minuten in PBS ein. Fahren Sie fort, die Zellen mit 1% BSA PBS mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur für eine Stunde zu blockieren.

Verdünnen Sie die Primärantikörper in 1 % BSA und PBST und inkubieren Sie die Proben 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie die primären Antikörperlösungen. Spülen Sie die Zellen dann dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.

Verdünnte Sekundärantikörper in die Zelle geben und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes verwerfen Sie die sekundären Antikörper. Spülen Sie die Zellen dann dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.

Färben Sie die Kerne mit DAPI bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Montieren Sie die Dias mit dem Montagemedium und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Betrachten Sie die Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Rastermikroskop, das mit einem Objektiv mit 63-facher Vergrößerung und numerischer Apertur von 1,40 ausgestattet ist, und zeichnen Sie sie zur weiteren Analyse auf.

Die Immunfluoreszenzfärbung der Kontroll- und CENP-E-Mutantengruppen zeigte, dass die Fluoreszenzintensitäten der CENP-E-Proteine in den CENP-E-mutierten Klon-1-Zellen vollständig ausgeschaltet und in den CENP-E-mutierten Klon-3-Zellen signifikant verringert waren. Die Verhältnisse von Metaphasezellen mit Chromosomenfehlstellung nahmen in Klon 1 und 3 im Vergleich zu den Kontrollzellen zu. Währenddessen stiegen die Verhältnisse der Metaphase-Zellen in Klon-1-Zellen und Klon-3-Zellen signifikant an.

Darüber hinaus stieg das Verhältnis der Interphasenzellen in den Gruppen Klon 1 und 3 nach CENP-E-Deletion im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht an. Die Raten von Prophase-, Anaphase- und Telophase-Zellen waren nach CENP-E-Deletion leicht verringert, während die Raten von Metaphase-Zellen nach CENP-E-Deletion anstiegen.