Geben Sie zunächst 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu den HeLa-Zellen und inkubieren Sie sie zwei bis drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dissoziieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und säen Sie sie in neue Platten im Verhältnis eins zu vier für die Zellpassage. Um das Plasmid in HeLa-Zellen zu transfizieren, mischen Sie ein Mikrogramm validiertes PX458-sgRNA-Plasmid mit 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium im Röhrchen A.In Röhrchen B, mischen Sie vorsichtig zwei Mikroliter des Transfektionsreagenzes und 50 Mikroliter reduziertes Serummedium und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Kombinieren Sie dann den Inhalt aus den Röhrchen A und B und inkubieren Sie weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie die Mischung in die 12-Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie das Medium am Ende der Inkubation durch frisches DMEM-Medium.
Beurteilen Sie nach 24 oder 48 Stunden die Transfektionseffizienz, indem Sie die HeLa-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Dissoziieren Sie die transfizierten HeLa-Zellen vollständig mit 0,25 % Trypsin-EDTA und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer oder einem automatisierten Zellzähler.
Plattieren Sie die Zellen in drei separate 96-Well-Platten für jede transfizierte Population nach seriellen Verdünnungsmethoden. Stellen Sie die Zellen für ein bis zwei Wochen in einen befeuchteten Inkubator. Für das phänotypbasierte Screening und die Validierung von CENP-E Knockout dissoziieren und expandieren Sie die Zellen fünf bis sieben Tage lang in 24-Well- oder 12-Well-Platten.
Untersuchen Sie die mutierten Zellen mit kleineren Koloniedurchmessern mit einem inversen Mikroskop mit Objektivlinsen mit 10-facher und 20-facher Vergrößerung. Ernten Sie als Nächstes die Zellen für die DNA-Extraktion, indem Sie das Column Animal Genomic DNA Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden und die Polymerase-Kettenreaktionen einrichten. Ligate der Ziel-DNA in den pMD18-T-Vektor gemäß den Protokollen des Herstellers.
Transfizieren Sie das ligierte Plasmid in kompetente DH5-Alpha-Zellen und fahren Sie mit der Kultur für die Klonauswahl fort. Um die Arten von CENP-E Knockout zu identifizieren, isolieren Sie die Plasmid-DNA mit Hilfe eines Plasmid-Extraktionskits gemäß den Richtlinien des Herstellers. Führen Sie als Nächstes eine Sanger-Sequenzierung für die Plasmid-DNA jeder Kolonie mit M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern durch.
Aussaat der Wildtyp- und CENP-E-Mutanten-HeLa-Zellen auf 12-Millimeter-Glasdeckgläsern in einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie das gesamte DMEM-Medium und fixieren Sie die Zellen mit einer 4%igen Paraformaldehyd- und PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Als nächstes färben Sie die Kerne fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI.
Beobachten und validieren Sie die CENP-E-Mutantenzellen basierend auf dem Phänotyp der Chromosomenausrichtung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Das phänotypische Screening der Kolonien zeigte, dass die CENP-E Knockout-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe eine erhöhte Chromosomenfehlstellung aufwiesen.
