Chromosomenpräparation und Karyotypanalyse von CRISPR/Cas9-vermittelten CENP-E-Knockout-HeLa-Zellen

Nehmen Sie zunächst die Wildtyp- und CENP-E-mutierten HeLa-Zellkulturen und fügen Sie 300 nanomolare Colchicin hinzu, bevor Sie sie fünf Stunden lang inkubieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang mit 0,25 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius und sammeln die Zellen in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1000 g, verwerfen Sie die Überstände und fügen Sie 1,2 Milliliter 0,075 molare Kaliumchloridlösung hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 0,2 Milliliter Fixierlösung für das Präfix hinzu. Eine Minute lang vorsichtig mischen, dann die Zellpellets wie zuvor gezeigt sammeln und 10 Minuten lang 1,5 Milliliter Fixierlösung bei Raumtemperatur hinzufügen.

Nach dem Zentrifugieren der Zellen und dem Verwerfen des Überstands werden 0,6 Milliliter der Fixierlösungen hinzugefügt, um eine Zellsuspension herzustellen. Lassen Sie vorsichtig drei bis fünf Tröpfchen der Zellsuspensionen aus 35 bis 40 Zentimetern Höhe auf die Eisobjektträger fallen. Trocknen Sie die Objektträger sofort mit einer Alkohollampe und färben Sie sie sieben Minuten lang mit der 10%igen Giemsa-Haltelösung.

Spülen Sie die Objektträger zwei Minuten lang mit fließendem Wasser ab und untersuchen Sie die Proben dann mit einem Lichtmikroskop, das mit einem Plan Fluor-Objektiv mit 40-facher Vergrößerung und numerischer Apertur und 0,75 ausgestattet ist. Die Karyotypanalyse ergab eine verringerte Chromosomenzahl in den CENP-E-mutierten HeLa-Zellen im Vergleich zu den Wildtyp-Zellen.