Bereiten Sie zunächst den 2X-Puffer für die RT-qPCR in DNase/RNase-freiem Wasser vor. Lagern Sie den Puffer bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes mischen Sie die Primer und die Sonden in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Füllen Sie das Volumen mit Elutionspuffer auf. Lagern Sie das Röhrchen dann bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Enzymmischung mit Taq-Polymerase und M-MLV RT in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor.
Füllen Sie das Volumen mit Taq-Polymerase-Speicherpuffer auf. Suspendieren Sie nun die viralen synthetischen RNAs in separaten Röhrchen mit 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer, um Vorräte von 10 bis der sechsten RNA-Kopie pro Mikroliter herzustellen. Um die Virusvorräte zu mischen, fügen Sie je fünf Mikroliter SARS-CoV-2 Influenza A und B zu 50 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer hinzu.
In ähnlicher Weise mischen Sie SARS-CoV-2 und MERS-CoV, um eine zweite Virusmischung zu erhalten. Beide Mischungen werden verzehnfacht, um eine endgültige Verdünnung von 10 RNA-Kopien pro Mikroliter zu erhalten. In jede Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettieren Sie 2X Puffer, Primer, Enzym, DNase/RNase-freies Wasser und die entsprechenden RNA-Mischungen.
Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Plattendichtung. Zentrifugieren Sie dann die Platte eine Minute lang, um die Flüssigkeit am Brunnenboden aufzufangen. Als Nächstes programmieren Sie das PCR-Gerät so, dass es den schnellen 96-Well-Blocktyp akzeptiert, wobei der experimentelle Typ auf die Standardkurve eingestellt ist.
Stellen Sie die Reagenzien auf TaqMan-Reagenzien ein und wählen Sie die Eigenschaften des Standardlaufs aus. Definieren Sie die Genziele und den Reporterfarbstoff. Definieren Sie dann die Probennamen für jede zu testende Reaktion und weisen Sie dem Plattenlayout Targets und Proben zu.
Geben Sie nun das Zyklusprogramm in das Gerät ein. Übertragen Sie die Platte in der richtigen Ausrichtung auf das real-time qPCR-Gerät und drücken Sie auf Lauf, um den Zyklus zu starten. Wählen Sie den Speicherort der Datei aus, um die experimentellen Daten zu speichern.
Untersuchen Sie dann die vom qPCR-Programm bereitgestellten Amplifikationsdiagramme. Die beiden entwickelten Kits waren in der Lage, alle drei Zielgene gleichzeitig mit nur 10 RNA-Kopien pro Reaktion erfolgreich zu amplifizieren. Die Amplifikationseffizienzen für alle viralen Titrationen lagen bei über 99%
