Reinigen Sie zunächst den Bankbereich mit 70% Ethanol. Spülen Sie dann eine Fünf-Mikroliter-Glasspritze mehrmals mit Chloroform aus. Waschen Sie die kohlenstoffverdampften Gitter kurz vor Gebrauch mit 100% Ethanol.
Trocknen Sie die Gitter auf einem sauberen Filterpapier. Waschen Sie in der Zwischenzeit jede Antikapillarpinzette mit 100 % Chloroform, gefolgt von 100 % Ethanol. Bereiten Sie drei 50-Mikroliter-Tropfen Kristallisationspuffer auf der sauberen Seite eines Parafilms für jedes vorzubereitende Gitter vor.
Füllen Sie den Deckel mit dem Kristallisationspuffer und wischen Sie die Oberfläche einer 35 Millimeter großen unbeschichteten Petrischale mit Linsenpapier ab. Streuen Sie genügend wissenschaftliches Talkumpuder um den Umfang der Petrischale. Tauchen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in das Rizinusöl, um einen mittelgroßen Tropfen aufzunehmen.
Berühren Sie den Tropfen auf die Oberfläche des Puffers in der Petrischale. Spülen Sie die Fünf-Mikroliter-Glasspritze zweimal mit dem gelösten Lipid aus, bevor Sie ein Aliquot aufnehmen. Berühren Sie dann vorsichtig das hängende 0,5-Mikroliter-Lipidtröpfchen an der Oberfläche des Rizinusöls und bilden Sie in der Mitte eine Lipid-Monoschicht.
Bereiten Sie einen Teller mit mehreren aufeinanderfolgenden Tropfen Flüssigkeit vor. Nehmen Sie ein Gitter mit einer Antikapillarpinzette auf, so dass der gerade Arm der Pinzette und die kohlenstoffverdampfte Seite des Gitters zur Monoschicht zeigen. Um die Monoschicht zu übertragen, berühren Sie die kohlenstoffverdampfte Seite des Gitters für ein bis zwei Sekunden mit der Monoschicht.
Berühren Sie die kugelförmige Kappe des Puffers nacheinander mit den drei 50-Mikroliter-Tropfen Kristallisationspuffer, die auf den Parafilm gelegt wurden. Geben Sie vier Mikroliter Streptavidin in die verbleibende kugelförmige Kappe des Puffers auf dem Gitter. Inkubieren Sie das Gitter zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer.
Bereiten Sie einen 300-Mikroliter-Tropfen Spülpuffer auf der sauberen Seite eines Parafilms vor. Legen Sie das Gitter auf den 300-Mikroliter-Tropfen Spülpuffer, um das ungebundene Streptavidin zu waschen. Um das Gitter aufzunehmen, stecken Sie den geknickten Arm einer trockenen Antikapillarpinzette in den Tropfen.
Tupfen Sie den Rost mit Filterpapier ab, legen Sie ihn mit der Goldseite nach unten auf und trocknen Sie ihn 15 bis 20 Minuten lang. Nach dem Trocknen den Rost so umdrehen, dass die Goldseite nach oben zeigt. Legen Sie die Gitter in den Kohleverdampfer, um eine dünne Schicht Kohlenstoff auf die Goldseite des Gitters aufzutragen.
Die Mikroskopaufnahme einer biotinylierten Probe, die mit Streptavidin-Affinitätsgittern eingefroren wurde, zeigte ein kontinuierliches Gittermuster im Hintergrund. Das Beugungsmuster in der schnellen Kürschnertransformation bestätigte eine erfolgreiche Gitterbildung. Nach der Kryo-EM-Datenerfassung konnte das vom Streptavidin-Gitter beigesteuerte Signal rechnerisch maskiert werden, um eine subtrahierte Mikroskopaufnahme zu erstellen.
Die Ergebnisse der schnellen Kürschnertransformation zeigten, dass das Beugungsmuster für Streptavidin erfolgreich entfernt wurde.
