Verwenden Sie zunächst eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter 10 millimolares Cystein in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte in einer sterilen Haube zu pipettieren. Nach dem Inkubieren der Platte die Lösung vorsichtig aus der Vertiefung absaugen und Kratzen an der Elektrode vermeiden. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit sterilem entionisiertem Wasser aus.
Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter frisch zubereitetes Rattenschwanzkollagen in einer Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei schwachem Licht, bevor Sie sie zweimal mit entionisiertem Wasser waschen. Übertragen Sie als Nächstes die entnommenen Endothelzellen des Gehirns in einen frischen sterilen Trog.
Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung und schließen Sie die Aussaat in 30 Sekunden ab. Bewahren Sie ein Well-Medium nur für mathematische Modellierungszwecke auf. Verschieben Sie bei einem 96-Well-Plattenadapter die roten Clips auf jeder Seite nach außen, damit die Platte eingesetzt werden kann. Richten Sie die Vertiefung A one der Platte genau an der Region A one des Adapters aus und üben Sie sanften Druck auf die Oberseite der Platte aus, um sie sicher an Ort und Stelle zu halten.
Verriegeln Sie dann die roten Klammern wieder. Drücken Sie nach dem Schließen des Inkubators auf Set-up, um das Instrument zu starten, alle korrekt erkannten Vertiefungen werden durch eine grüne Farbe auf der Plattenkarte angezeigt. Drücken Sie die Prüftaste, um die absoluten Impedanzanzeigen zu authentifizieren.
Verwenden Sie nun das Dropdown-Menü unter der Plattentabelle, um den Typ der Platte auszuwählen, die für das Experiment verwendet werden soll. Wählen Sie Multifrequenz, um die Impedanz bei verschiedenen Wechselstromfrequenzen zu messen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Start, um das Experiment zu starten.
Lassen Sie die Zellen vermehren, bis sich eine Monoschicht mit hohem Widerstand bildet, was durch einen Anstieg der Ohm angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass das Zellwachstum ein Plateau erreicht hat, bevor Sie Behandlungslösungen herstellen. Zur Herstellung von Behandlungslösungen legen Sie beschriftete 1,1-Milliliter-Polypropylen-Cluster-Röhrchen in Streifenröhrchenplatten.
Geben Sie drei 50-Mikroliter der Behandlungszytokine oder -zellen in das Röhrchen, indem Sie einer vorgefertigten Plattenkarte folgen. Legen Sie sie dann zum Wärmen in den Inkubator. In der EISs-Software.
Klicken Sie auf Pause, um das laufende Experiment vorübergehend zu stoppen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, öffnen Sie den Inkubator und lösen Sie vorsichtig die beiden roten Clips, während Sie die Platte ruhig halten. Wenn sich das Experiment noch im pausierten Zustand befindet, übertragen Sie die Platte in die sterile Haube.
Nehmen Sie dann die abgestreiften Behandlungsröhrchen aus dem Inkubator. Mit einer Mehrkanalpipette. Den Inhalt der abgestreiften Schläuche vorsichtig wieder auflockern.
Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter Behandlung aus den abisolierten Röhrchen heraus und überführen Sie sie in die entsprechenden Vertiefungen auf der 96-Well-Platte, geben Sie nur vollständiges Medium in die zellfreien Vertiefungen. Versuchen Sie, das Pipettieren in weniger als fünf Minuten abzuschließen, da eine übermäßige Abkühlung der Platte den Widerstand der Endothelzell-Monoschicht beeinträchtigen kann. Bringen Sie die behandelte Platte wieder an der Maschine an und prüfen Sie dann, ob die Impedanz der Elektrodenvertiefung beurteilt wird.
Vergewissern Sie sich, dass die richtigen Einstellungen für die Mehrfrequenzerfassung und den richtigen Plattenkatalog ausgewählt wurden. Drücken Sie dann auf Fortsetzen, um das Experiment fortzusetzen. Sobald das Experiment den gewünschten Endpunkt erreicht hat, drücken Sie auf Fertig stellen, um die aufgezeichnete Datei automatisch zu speichern.
Navigieren Sie zu Datei und klicken Sie auf Daten exportieren, um die Daten zur weiteren Analyse als XLS- oder CSV-Datei zu exportieren. Es wurde ein Anstieg der Resistenz über 30 Stunden beobachtet, was auf die Wachstumsphase der Endothelzellen hinweist. Während der Wachstumsphase erreichten die Zellen nach 48 Stunden ein Plateau auf unterschiedlichen Niveaus, die Normalisierung der Messung ermöglichte eine zuverlässigere Interpretation der Resistenzänderungen.
Eine falsche Zellzahl der Endothelzellen des Gehirns vor der Behandlung führte zu einer fluktuierenden Wachstumsphase, die allmählich in ein stabiles Resistenzplateau absank. Eine optimierte Zellaussaatdichte und ein optimiertes Ladevolumen führten zu einer optimalen Wachstumsphase. Zytokine schienen eine vorübergehende Wirkung auf die Barriere zu haben.
Die Zugabe von Melanomzellen reduzierte die Barriereresistenz drastisch. Die parazelluläre Barriere und die basolaterale Komponente schwankten mit der Zugabe von Zytokinen, die Zugabe von Melanomzellen führte zu einer größeren Abnahme der parazellulären Barriere im Vergleich zur basolateralen Komponente.
