Beginnen Sie mit der Beschichtung von SHSY 5Y-Zellen in Glasbodenzellenschalen mit einer Dichte von 15 x 10 Strahlen auf die Leistung von vier Zellen pro Milliliter. Behandeln Sie die Zellen fünf Tage lang mit All-trans-Retinsäure in 1%FBS-haltigem Kulturmedium, gefolgt von einer Behandlung mit einem aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor für zwei Tage. Waschen Sie dann die Zellen mit sterilem PBS.
Behandeln Sie die Zellen 72 Stunden lang mit 10 bis 7 molaren RA oder Isoform-Agonisten zu gleichen Teilen mit MEM und F12-Medium in Kombination mit 1% FBS. Ersetzen Sie das Medium durch frisches 1%FBS-haltiges Kulturmedium, gemischt mit 20 nanomolaren TMRM für 45 Minuten. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator, der mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop verbunden ist, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Nehmen Sie die Bilder mit einem apochromatischen 63-fachen Ölimmersionsobjektiv auf. Stellen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel mit einer Lochblende von einer Flächeneinheit ein. Erfassen Sie eine Zeitreihe von 15 Frames aus fünf verschiedenen Sichtfeldern in jeder Zellplatte und einem Z-Stapel mit acht gleich weit entfernten Z-Ebenen.
Die resultierende LSM-Datei sollte Zeit-, Positions- und Z-Stapel-Daten enthalten.
