Nehmen Sie zunächst ein Röhrchen mit vom Patienten stammenden Organoiden oder PDO-Suspension in einer gleichen Menge Basalmembranextrakte oder BME. Säen Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette fünf Mikroliterkuppeln in die Mitte jeder Vertiefung einer vorgewärmten 96-Well-Platte. Nachdem Sie alle Vertiefungen ausgesät haben, legen Sie den Deckel auf die Platte und drehen Sie ihn vorsichtig um.
Inkubieren Sie die umgekehrte Platte bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten im Gewebekultur-Inkubator, damit sich die Kuppeln verfestigen können. Drehen Sie die Platte um, so dass der Deckel nach oben zeigt. Dann erneut inkubieren.
Nach Zugabe von Fluoreszenzfarbstoffen und Medikamenten zu den Platten, die die g.U. enthalten. Legen Sie die Platte in Zitat fünf. Starten Sie die Gen5-Software und wählen Sie im Task-Manager-Fenster den manuellen Imager-Modus und klicken Sie auf Jetzt erfassen.
Geben Sie in den Einstellungen das Objektiv, den Filter, das Mikroplattenformat und den Gefäßtyp an, wählen Sie Deckel verwenden und langsamere Trägergeschwindigkeit verwenden und klicken Sie auf OK. Dann wählen Sie einen Brunnen von Interesse. Wählen Sie den Hellfeldkanal aus, klicken Sie auf Auto Expose und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an.
Erweitern Sie als Nächstes zum Einrichten des Z-Stapels die Registerkarte Imaging-Modus, wählen Sie Z-Stapel und passen Sie den Fokus mit den Kursanpassungspfeilen an, bis alle PDOs unscharf sind. Legen Sie diesen Punkt als den unteren Rand des Z-Stapels fest und wiederholen Sie den Vorgang in umgekehrter Reihenfolge, um den oberen Rand festzulegen. Richten Sie anschließend die Fluoreszenzkanäle ein, indem Sie den Schritt "Bildgebung bearbeiten" öffnen.
Wählen Sie unter Kanäle die gewünschte Anzahl von Kanälen aus, legen Sie einen Kanal für das Hellfeld und zusätzliche Kanäle für jeden Leuchtstoffkanal fest. Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf OK klicken, ändern Sie das Dropdown-Menü in GFP, um die Belichtung für den ersten Fluoreszenzkanal einzustellen, klicken Sie auf automatisch belichten und passen Sie die Belichtungseinstellungen auf der Registerkarte Belichtung an, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Um die Belichtungseinstellungen auf die Registerkarte "Bildmodus" zu kopieren, klicken Sie auf das Symbol "Kopieren" und dann auf "Imaging-Schritt bearbeiten", um ein neues Fenster zu öffnen.
Klicken Sie im GFP-Kanal auf das Zwischenablagesymbol in der Belichtungszeile, um dem Kanal Einstellungen für Beleuchtung, Integrationszeit und Kameraverstärkung hinzuzufügen. Klicken Sie nun auf das Kamerasymbol und wählen Sie unter Verarbeitungsschritt hinzufügen die Bildvorverarbeitung. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte Hellfeld die Option Bildvorverarbeitung anwenden.
Stellen Sie sicher, dass für jede Registerkarte des Fluoreszenzkanals die Option Bildvorverarbeitung anwenden aktiviert ist. Deaktivieren Sie die Option, verwenden Sie dieselben Optionen wie Kanal eins, und klicken Sie dann auf OK, um das Fenster zu schließen. Klicken Sie nun unter dem Verarbeitungsschritt hinzufügen auf Z-Projektion, passen Sie ggf. den Schichtbereich an und schließen Sie das Fenster mit OK.
Um das Protokoll für die kinetische Bildgebung einzurichten, klicken Sie in der Symbolleiste auf Bildsatz und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Experiment aus diesem Bildsatz erstellen. Klicken Sie auf Optionen unter der anderen Überschrift und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das diskontinuierliche kinetische Verfahren. Geben Sie unter Geschätzte Gesamtzeit die Laufzeit für das Experiment ein.
Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf OK klicken. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem das Plattenlayout und den Temperaturgradienten ein. Überprüfen Sie die Schritte zur Datenreduzierung, indem Sie sich durch die Fenster klicken.
Navigieren Sie dann zu Datei und klicken Sie in der Symbolleiste auf Protokoll speichern unter. Wählen Sie einen Speicherort aus. Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.
Um mit der kinetischen Bildgebung zu beginnen, laden Sie das Protokoll in die Bio-Spa-On-Demand-Planungssoftware und wählen Sie einen verfügbaren Steckplatz aus. Wählen Sie auf der Registerkarte "Verfahrensinformationen" die Option "Benutzer" aus dem Menü aus. Klicken Sie neben dem Protokollslot auf Auswählen und wählen Sie Neuen Eintrag hinzufügen.
Klicken Sie nun neben dem Protokollsteckplatz auf Auswählen. Klicken Sie auf Öffnen, um zu navigieren und das Protokoll in die Planungssoftware zu importieren. Geben Sie die erforderliche Belichtungszeit für die Platte ein und klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen.
Geben Sie unter Intervall die gewünschte Bildgebungshäufigkeit ein, wählen Sie Zeitplan, Platte oder Gefäß aus, um die Plattenvalidierungssequenz zu starten, und klicken Sie auf Ja, um diesen Zeitplan zu akzeptieren.
