Zu Beginn isolieren und kultivieren Sie die äußere Schicht der Aorta und den ersten Ast der Mesenterialarterien, die von der anästhesierten Maus isoliert wurden. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, zentrifugieren Sie die dissoziierte Zellsuspension bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Zellpellet in 98 Mikrolitern Sortierpuffer pro 10 Millionen Zellen insgesamt. Nach der Zugabe von CD34-Antikörpern inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius.
Um die Zellen zu waschen, geben Sie zwei Milliliter Sortierpuffer in die Zellen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 g. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen in 80 Mikrolitern Sortierpuffer resuspendiert. Geben Sie dann 20 Mikroliter Anti-FITC-Mikroperlen in die Zellsuspension.
Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gezeigt gewaschen und zentrifugiert haben, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Sortierpuffer. Positionieren Sie als Nächstes eine magnetische Trennsäule innerhalb des Magnetfelds eines Separators und platzieren Sie ein Sammelrohr unter der Säule. Nach dem Spülen mit 500 Mikrolitern Puffer laden Sie die Zellsuspension in die Säule und sammeln den Durchfluss mit den unmarkierten Zellen im Sammelröhrchen.
Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und stellen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Sortierpuffer in die Säule und schieben Sie den Kolben in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen.
