Um die CD34+-Stammzellen zu charakterisieren, die aus der murinen Aorta und den mesenterialen Arterien isoliert wurden, führen Sie eine Gewebeblockkultur durch und gewinnen Sie die Zellen durch magnetische Trennung. Um die Endothelzelle in der Expression von Fibroblastenzellmarkern nach der Differenzierung nachzuweisen, werden die Zellen bei 40-facher Vergrößerung mit Laseranregungen von 488 Nanometern beobachtet. Nach der Trypsinisierung der Zellen werden sie durch Zentrifugation pelletiert und in 100 Mikrolitern Sortierpuffer resuspendiert.
Dann inkubieren Sie sie fünf Minuten lang mit monoklonalen Anti-Maus-CD16/CD32-Antikörpern bei vier Grad Celsius. Fügen Sie dann zwei Mikroliter jedes gewünschten monoklonalen Antikörpers für die Immunfluoreszenzfärbung hinzu und inkubieren Sie erneut 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter Puffer.
Nachdem Sie die Zellen wie gezeigt zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern Puffer. Übertragen Sie die Zellen in die Durchflussrohre und legen Sie sie in eine Eisbox. Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um den Prozentsatz der differenzierten Zellen zu überprüfen.
Die durchflusszytometrische Auswertung bestätigte die hohe Reinheit der isolierten CD34+Gefäßwand-Stammzellen. Die zelluläre Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die isolierten CD34+-Stammzellen überwiegend die Stammzellmarker CD34, c-kit und Flk-1 exprimierten. Die Durchflusszytometrie bestätigte auch, dass die isolierten CD34+-Stammzellen die Fähigkeit besaßen, sich sowohl in Endothelzellen als auch in Fibroblasten in vitro zu differenzieren.
