Montieren Sie zunächst einen sauberen Glasobjektträger auf der experimentellen Badkammer. Beschichten Sie den Objektträger mit zwei bis drei Mikrolitern Laminin und lassen Sie ihn 30 Sekunden trocknen. Gießen Sie dann etwa 400 Mikroliter der Muskelfasersuspension auf den Objektträger und lassen Sie die Fasern 10 bis 15 Minuten lang am Laminin haften.
Stellen Sie die Experimentierkammer auf den Tisch eines inversen Mikroskops, das für Epifluoreszenz ausgestattet ist. Um die Lebensfähigkeit der Fasern zu überprüfen, platzieren Sie zwei Platinelektroden auf beiden Seiten der Versuchskammer. Beobachten Sie nach dem Anlegen von rechteckigen Stromimpulsen für 0,8 bis 1,2 Millisekunden die Muskelfaserkontraktionen an den Extremen.
Laden Sie die Fasern vier bis fünf Minuten lang mit 3,5 bis 4,5 Mikromolaren des schnellen Calciumfarbstoffs Mag-Fluo-4 AM in Tyrodelösung. Lassen Sie den Objektträger nach dem Waschen mit Tyrode-Lösung 15 bis 20 Minuten im Dunkeln entestern. Sammeln und speichern Sie bei der Erfassung von Calciumtransienten bei gedimmter Beleuchtung die Lichtsignale mit einem 40X-Ölimmersionsobjektiv und einer Photomultiplierröhre, die an einen Digitalisierer angeschlossen ist.
Stellen Sie in der Erfassungssoftware eine Skala von null bis 200 beliebigen Einheiten sicher. Passen Sie dann die Größe des Anregungsflecks und die Verstärkung der Photomultiplierröhre an, um die Ruhefluoreszenz oder F-Rest auf 10 beliebige Einheiten einzustellen. Um die Aufzeichnungen zu analysieren, stellen Sie einen Tiefpassfilter auf die gesamte Kurve bei einem Kilohertz ein.
Passen Sie dann den Peak an, um den F-Rest in einer Sekunde der Kurve zu berechnen. Stellen Sie die F-Stütze auf Null und messen Sie die Amplitude der maximalen sarkoplasmatischen Kalziumtransiente. Messen Sie die Anstiegszeit von 10 % bis 90 % der Amplitude, die Dauer beim halben Maximum und die Abklingzeit von 90 % bis 10 % der Amplitude.
Schätzen Sie dann die Zerfallskinetik gemäß einer Anpassung mit der biexponentiellen Funktion. Berechnen Sie die maximale Kalziumkonzentration in mikromolaren Molekülen. Speichern Sie abschließend die Werte der Zeitkonstanten des Zerfalls tau 1 und tau 2 sowie der Amplituden A1 und A2. Die FDB- und EDL-Muskeln zeigten eine Calciumkinetik, die als Morphologie bekannt ist, Typ II, Soleus-Muskeln zeigten morphologische Typ-I-Calciumtransienten.
Fasern aus PDQA-, PL- und EHL-Muskeln teilten die Typ-II-Morphologie. Die kinetischen Signale des Calciumtransienten von PDQA, PL und EHL ähnelten den Signalen der FDB-EDL-Muskeln, unterschieden sich jedoch von den Signalen des Soleus-Muskels.
