Schneiden Sie zunächst das Filterpapier in eine rechteckige Form von etwa 17 x 20 Millimetern und entfernen Sie die vier Ecken. Erstellen Sie dann etwa sieben mal 10 Millimeter hohle Mitte im Filterpapier. Befestigen Sie einen handelsüblichen Ring an einer flexiblen Folienschicht und erzeugen Sie eine hohle Mitte in der flexiblen Folienschicht.
Legen Sie einen vorbereiteten Ring in eine 35-Millimeter-Petrischale. Nehmen Sie das Ei nach der Vorkultivierung aus dem Inkubator und legen Sie es auf seiner Längsachse auf die Eierkartonschale. Reinigen Sie die gesamte Oberfläche der Eierschale mit 70% Ethanol und lassen Sie sie 15 Minuten ruhen.
Halten Sie das Ei auf seiner kurzen Achse und schlagen Sie es unten auf. Öffnen Sie das Ei über einer sauberen 100-Millimeter-Petrischale, um seinen Inhalt zu extrahieren. Übertragen Sie mit einer Pipette etwa 10 Milliliter des dünnen Albumins in ein 15-Milliliter-Röhrchen für die Ex-Ovo-Kultur.
Füllen Sie die mittlere Vertiefung der Kulturschale mit dünnem Albumin. Entfernen Sie vorsichtig mit Seidenpapier das dicke Albumin, das an der Vitellinmembran des Embryos haftet. Befestigen Sie nun das Filterpapier vorsichtig an der Vitellinmembran und stellen Sie sicher, dass die Körperachse des Embryos mit dem mittleren Rechteck auf dem Filterpapier ausgerichtet ist.
Schneiden Sie die Membran, die das Filterpapier umgibt, mit einer Schere ab. Ziehen Sie das isolierte Filterpapier mit einer Pinzette vorsichtig in schräger Richtung vom Joch weg. Drehen Sie das Filterpapier auf den Kopf, um den Embryo mit der Rückenseite nach unten zu positionieren.
Tauchen Sie das gesamte Filterpapier vorsichtig von einer Seite der Längsachse in die 100-Millimeter-Petrischale mit Waschmedium. Sprühen Sie das Waschmedium mit einer sauberen Pipette vorsichtig parallel zum Filterpapier auf, um Eigelbreste zu entfernen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Filterpapier vom Waschmedium und verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssiges Medium von den Rändern des Embryos zu absorbieren.
Legen Sie das Filterpapier mit dem Embryo auf die Kulturschale und achten Sie darauf, dass die dorsale Seite des Embryos nach unten zeigt. Bringen Sie die Kulturschale in den Inkubator auf der Bühne für die Ex-Ovo-Kultur. Füllen Sie die Kulturschalen mit einem warmen Waschmedium.
Wenn der Embryo ein gewünschtes Entwicklungsstadium erreicht hat, geben Sie das Filterpapier mit dem Embryo in die mit einem Waschmedium gefüllte Kulturschale. Stellen Sie die Kulturschale in den Inkubator des Brillouin-Mikroskops auf der Bühne. Messen Sie für den Kalibrierungsprozess das Brillouin-Signal von Wasser.
Messen Sie dann das Brillouin-Signal von Methanol. Stellen Sie bei der Hellfeldabbildung mit einer vierfachen Objektivlinse den Laserbeleuchtungspunkt auf das zweite Somitenpaar ein. Wechseln Sie dann zu einer 40-fachen Objektivlinse und führen Sie eine Feinjustierung des Laserpunkts in der Mitte des Neuralrohrs durch.
Entsperren Sie den Laserstrahl und stellen Sie die Fokusebene ein. Scannen Sie den Embryo mit einem zweidimensionalen Translationsstadium und nehmen Sie ein Brillouin-Bild der interessierenden Region auf. Entfernen Sie nach Abschluss des Scans vorsichtig das Filterpapier mit dem Embryo.
Verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssiges Waschmedium aus dem Embryo aufzunehmen. Legen Sie den Embryo zur kontinuierlichen Kultivierung zurück in die mit dünnem Albumin gefüllte Kulturschale. Laden Sie für die Brillouin-Bildrekonstruktion die Wasser- und Methanolsignaldaten.
Klicken Sie auf Bereich festlegen und wählen Sie den Bereich mit vier Punkten für die Berechnung der Kalibrierungsparameter aus. Speichern Sie die Kalibrierungsergebnisse. Laden Sie die Embryo-Scandaten und klicken Sie auf Start, um die Parameter zu verarbeiten.
Rekonstruieren Sie schließlich das 2D-Brillouin-Bild basierend auf den Brillouin-Verschiebungen aller Pixel. Die Brillouin-Verschiebung im geschätzten Längsmodul der Neuralplatte gegenüber der Somitenzahl und der Inkubationszeit zeigte eine Zunahme der Brillouin-Verschiebung des Gewebes während des Neuralrohrverschlusses.
