Beginnen Sie mit der Aufbewahrung HEK293T Zellen und DMEM, die hitzeinaktiviertes FBS, Penicillin und Streptomycin enthalten, in einem T75-Kolben. Mischen Sie für die Zellzählung 20 Mikroliter Zellsuspension mit 20 Mikrolitern Trypanblaulösung. Geben Sie 20 Mikroliter farbstoffgemischte Zellsuspension in die Zellzählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter.
Aussaat HEK293T Zellen und 10 Milliliter vollständiges DMEM in einer 10 Zentimeter großen Zellkultur-Petrischale. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag das komplette Medium und ersetzen Sie es durch neun Milliliter DMEM-serumfreies Medium.
Bereiten Sie unter Verwendung der gegebenen Verbindungen der Viruspartikelanordnung eine Kotransfektionsmischung vor. Geben Sie die Mischung langsam in die Petrischale und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach der Inkubation das serumfreie DMEM durch ein vollständiges DMEM-Medium und setzen Sie die Inkubation für die Kotransfektion bis zu 48 Stunden fort.
Trennen Sie dann die Zellen, indem Sie wiederholt über die Oberfläche der Monoschicht pipettieren, und übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 400 g. Sammeln Sie den Überstand und lassen Sie ihn durch einen 0,22-Mikron-Filter.
Lagern Sie das Filtrat, das das Ha-CoV-2-Pseudovirus enthält, bei 80 Grad Celsius.
