Beginnen Sie mit der Resuspendierung des lyophilisierten Peptids MOG 35 55 in Wasser. Verdünnen Sie die Peptidbrühe vor dem Experiment auf 10 Mikrogramm pro Milliliter in Beschichtungspuffer. Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter der endgültigen Lösung in Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
Beschichten Sie gleichzeitig eine gleiche Anzahl von Wells mit 100 Mikrolitern BSA, gelöst in Beschichtungspuffer. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebefolie, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius. Führen Sie am nächsten Tag drei Wäschen der Platte mit 200 Mikrolitern PBS durch, die mit 0,5 % zwischen 20 ergänzt werden.
Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter pro Vertiefung einer Blockierungslösung hinzu, die aus 3%BSA in PBS besteht. Inkubieren Sie die versiegelte Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen. Waschen Sie die Platte nach der Inkubation dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Vertiefung.
Verdünnen Sie jede Serumprobe, die aus dem Blut von EAE-immunisierten Mäusen gewonnen wurde, in Blockierungslösung und geben Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung in MOG 35, 55 und BSA-beschichtete Vertiefungen. Geben Sie das gleiche Volumen der Blockierungslösung in die dafür vorgesehenen Blindvertiefungen. Inkubieren Sie die versiegelte Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln.
Nehmen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator und spülen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Vertiefung aus. Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper in einer Lösung, die aus 0,2 % BSA in PBST besteht, und geben Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die versiegelte Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln.
Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Vertiefung. Geben Sie 100 Mikroliter drei, drei Prime-, fünf, fünf Prime-Tetramethylbenzidin-Substrats in jede Vertiefung. Inkubieren Sie im Dunkeln für ein bis fünf Minuten und beobachten Sie die Entwicklung einer blauen Farbe.
Geben Sie 100 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung. Verwenden Sie dann ein Plattenlesegerät, das auf eine Wellenlänge von 450 Nanometern eingestellt ist, um die optische Dichte in jedem Well zu messen. Die optischen Dichtewerte der EAE-Proben waren signifikant höher als die der Kontrollproben, was auf eine robuste Immunglobulin-G-Antwort gegen das MOG-Peptid hinweist.
