Geben Sie zunächst die Samen von Brassica napus DH12075 in Mikroröhrchen. Um die Samen zu entfetten, geben Sie Wasser und 0,1 % Reinigungsmittel in das Mikroröhrchen und schütteln Sie es 60 Sekunden lang. Spülen Sie nun die Samen mit Wasser und anschließend mit 70% Ethanol jeweils 60 Sekunden lang ab.
Als nächstes legen Sie die Samen in eine 10%ige Natriumhypochloritlösung und schütteln Sie sie 20 Minuten lang. Waschen Sie die Samen nach dem Entfernen des Bleichmittels viermal mit sterilem Wasser für jeweils 60 Sekunden. Legen Sie die Samen auf eine Petrischale, in der sich das Keimmedium der Samen befindet.
Stratifizieren Sie die Samen über Nacht bei vier Grad Celsius kalt, bevor Sie das Gericht in einen Anbauraum bringen. Nach fünf Tagen werden die Sämlinge in eine Pflanzenkulturbox mit einem Pflanzenwachstumsmedium umgefüllt. Inokulieren Sie Ti-less Agrobacterium tumefaciens C58C1 mit einem haarigen wurzelinduzierenden Plasmid PRIA 4B in fünf Millilitern LB-Medium.
Wachsen Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius, bis sie bei 600 Nanometern eine optische Dichte von 0,9 zu eins erreicht. Übertragen Sie das bakterielle Inokulum in die Spritze. Punktieren Sie mit einer 26-Gauge-Nadel, die an der Spritze montiert ist, das Hypokotyl eines 18 Tage alten Sämlings etwa einen Zentimeter über dem Wachstumsmedium.
Injizieren Sie ungefähr 50 Mikroliter Inokulum in die Wunde und kratzen Sie das Gewebe auf der Oberfläche des Hypokotyls. Bringen Sie die Pflanze für zwei bis vier Wochen bei 21 Grad Celsius in den Kultivierungsraum zurück. Als nächstes schneiden Sie die Hornhaut mit den ausgetretenen Haarwurzeln aus dem Hypokotyl ab.
Legen Sie die Hornhaut mit den Haarwurzeln auf eine Petrischale, die Haarwurzelwachstumsmedium und Antibiotika enthält, um das Wachstum von Agrobakterien zu unterdrücken. Verschließen Sie die Schale mit gasdurchlässigem Klebeband, bevor Sie sie bei 24 Grad Celsius inkubieren. Isolieren Sie nach der Inkubation die Haarwurzeln von der Hornhaut und übertragen Sie die einzelnen Wurzeln in ein Haarwurzel-Wachstumsmedium.
Um eine Verbundpflanze aus Wildtyp-Trieben und transgenen Haarwurzeln zu erzeugen, entfernen Sie alternativ die nativen Wurzeln der Pflanze. Setzen Sie dann die Pflanze mit den aufkommenden Haarwurzeln in eine Kulturbox um, die Pflanzenwachstumsmedium und Antibiotika enthält, um das Wachstum von Agrobakterien zu unterdrücken.
