Nach der Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut resuspendieren Sie sie in RPMI 1640 Medium in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie einen Mikroliter membrandurchlässigen roten DNA-Chip zu 1,5 Millilitern Neutrophilensuspension hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang im Dunkeln. Die neutrophile Suspension bei 2.500 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Nach dem Zentrifugieren wird das Röhrchen mit den pelletierten Neutrophilen entfernt und der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie die Neutrophilen in einem Milliliter RPMI und zentrifugieren Sie sie erneut. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Neutrophilen in einem Milliliter RPMI.
Geben Sie eine kleine Menge Neutrophilensuspension in das Hämozytometer und zählen Sie sie unter einem Mikroskop. Verdünnen Sie die Neutrophilensuspension mit RPMI auf 1,5 mal 10 bis zum fünften Neutrophilen pro Milliliter. Fügen Sie dem einen Milliliter Neutrophilensuspension vier Mikroliter von einem bis 100 vorverdünnten membranundurchlässigen grünen DNA-Farbstoff hinzu.
Geben Sie 100 Mikroliter Neutrophilensuspension pro Well in eine mit klarer Gewebekultur behandelte 96-Well-Platte. Geben Sie 100 Mikroliter RPMI-haltige Stimulusreagenzien mit oder ohne Inhibitor in die jeweiligen Wells. Legen Sie die Platte in ein Lebendzellanalysesystem, das in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator untergebracht ist.
