Starten Sie zunächst die Software für das Lebendzellanalysesystem. Drücken Sie auf das Plus-Symbol in der oberen linken Ecke des Bildschirms, um das Hinzufügen des Schiffes zu starten. Wählen Sie Nach Zeitplan scannen und dann Neu aus, um das Scanprogramm auszuführen.
Wählen Sie Standard aus. Legen Sie dann die Scaneinstellungen als Zellen-für-Zellen-Optionen auf Keine und die Bildkanäle auf Phase, Grün und Rot mit den entsprechenden Aufnahmezeiten fest. Setzen Sie sich das Ziel auf 20x.
Wählen Sie aus der Liste die Platte und wählen Sie die Position des Gefäßes aus, um die Platte auf das Fach des Bildgebungssystems zu legen. Wählen Sie die Wells aus, die Proben enthalten, und legen Sie die Anzahl der Bilder fest, die pro Well aufgenommen werden sollen. Diese Informationen generieren automatisch eine geschätzte Scandauer für die Platte.
Klicken Sie auf Plattenkarte erstellen, um Informationen für jedes Well einzugeben, z. B. Zelltyp und Verbindung. Benennen Sie dann die Studie. Wählen Sie auf dem nächsten Bild Basic Analyzer als Analysetyp und wählen Sie Analysedefinition aus der Dropdown-Liste, in der zuvor verwendete Analysedefinitionen angezeigt werden.
Lassen Sie die spektrale Entmischung für Grün und Rot bei 0,0. Planen Sie den Scan so ein, dass er acht Stunden lang alle 15 bis 20 Minuten durchgeführt wird. Ziehen Sie den weißen und grauen Balken oben auf dem Bildschirm, um die Startzeit des Scans festzulegen.
Überprüfen Sie auf dem nächsten Bildschirm die Scaneinstellungen und klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen, um den Scanvorgang zu starten. Öffnen Sie nach dem Scannen auf der Registerkarte Ansicht das Schiff zur Analyse. Drücken Sie auf der linken Seite des Bildschirms auf Analyse starten und wählen Sie Neue Analysedefinition erstellen.
Wählen Sie Basic Analyzer und verwenden Sie die Bildkanäle Phase, Grün, Rot und Überlappung. Wählen Sie sechs bis acht repräsentative Beispielbilder für das Training aus. Um die Analysedefinition zu konfigurieren, setzen Sie grüne Objekte auf Neutrophile, die extrazelluläre Neutrophilenfallen oder NETs bilden, und rote Objekte auf die Kerne aller Neutrophilen.
Drücken Sie Vorschau aktuell oder Vorschau aller und passen Sie jeden Parameter an, um die Ergebnisse zu optimieren. Wählen Sie die Scanzeiten und Wells für die Analyse aus. Geben Sie dann eine Beschriftung für die Analysedefinition an.
Überprüfen Sie die Zusammenfassung, und starten Sie die Analyse. Doppelklicken Sie nach der Analyse auf den Namen der Analysedefinition, um die analysierte Studie zu öffnen. Öffnen Sie Ebenen auf der linken Seite des Bildschirms und prüfen Sie, ob jede Zelle richtig markiert ist.
Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf Diagrammmetriken und wählen Sie dann Anzahl pro Bild für grüne Anzahl aus. Wählen Sie die zu exportierenden Zeitpunkte und Vertiefungen aus. Wählen Sie für die ausgewählte Gruppierung die Option Plate Map Replicates aus, um zu bestätigen, dass alle Wells während des Scannens korrekt angegeben wurden, und klicken Sie auf Daten exportieren.
Exportieren Sie auf ähnliche Weise die Daten für die rote Anzahl und die Überlappungsanzahl. Berechnen Sie mit der angegebenen Gleichung den Prozentsatz der NETs, die Zellen für jede Bedingung und jeden Zeitpunkt bilden. Der Zeitverlauf der NET-Bildung wird visualisiert, indem der Prozentsatz der NET-bildenden Neutrophilen zu jedem Zeitpunkt aufgetragen wird.
Die Zugabe eines AKT-Inhibitors blockierte die NET-Bildung in Neutrophilen, die mit PMA oder Calciumionophor stimuliert wurden. Der Nachweis der potenziellen Moleküle, die auf die NET-Bildung abzielen, kann mit dieser Methode im Hochdurchsatz getestet werden.
