Dreistreifige Shigella-Stämme auf Agarplatten mit Kongorot-Farbstoff, um sicherzustellen, dass die Kolonien virulent sind, und um die Verwendung von nicht virulenten Kolonien in Infektionstests zu verhindern. Nehmen Sie zunächst die über Nacht gewachsenen Shigella-Kulturen und wirbeln Sie sie ein. Geben Sie 100 Mikroliter der Kultur zu fünf Millilitern frischem TSB in einem Kulturröhrchen.
Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute, bis bei 600 Nanometern eine optische Dichte von 0,7 erreicht ist. 2 mal 10 in die 8 koloniebildenden Einheiten von subkultivierten Shigellen in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Saugen Sie den Überstand an. Fügen Sie einen Milliliter warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gründlich. Nachdem Sie die Zelle erneut zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern warmem DMEM und wirbeln Sie die Zellsuspension vor.
Geben Sie dann einen Milliliter resuspendierte Shigella und einen Milliliter DMEM in jede Vertiefung der HT29-Dickdarmepithel-Monoschichten in sechs Vertiefungsplatten. Um den bakteriellen Kontakt mit HT29-Zellen zu gewährleisten, zentrifugieren Sie die sechs Well-Platten bei 2.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie sechs Well-Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 45 Minuten.
Um den bakteriellen Infektionstiter zu bestimmen, bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen in PBS vor. 100 Mikroliter der 1 mal 10 auf die 5 und 1 mal 10 auf die 6 Verdünnungen mit TSB auf kongo rote Platten geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation wird das Medium aus jeder Vertiefung abgesaugt.
Geben Sie einen Milliliter warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig. Dann zwei Milliliter warmes DMEM mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Waschen Sie infizierte HT29-Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS.
Geben Sie zwei Milliliter warmes DMEM mit Gentamycin in jede Vertiefung und inkubieren Sie bis zu 24 Stunden lang für die intrazelluläre Replikation bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal mit einem Milliliter PBS. Geben Sie einen Milliliter PBS mit 1% Triton X-100 in jede Vertiefung, um HT29-Zellen zu lysieren.
Kratzen Sie dann mit einem Zellschaber oder einer gebogenen Pipettenspitze die lysierten Zellen von den Well-Böden ab und geben Sie die Mischung in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie jedes Röhrchen mindestens 30 Sekunden lang, um Shigella weiter aus den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen. Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen der Lysate und PBS vor.
100 Mikroliter der seriellen Verdünnungen mit TSB auf kongorote Platten auffüllen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
