Erstellung der Navigationskarte für CLEM und Vorbereitung der ultradünnen Schnitte für die Elektronenmikroskopie

Nehmen Sie zunächst einen ultradünnen Schnitt von Maushirngewebe, das mScarlet exprimiert. Geben Sie 10 Mikroliter Montagepuffer auf den ultradünnen Abschnitt des Deckglases und setzen Sie ein neues sauberes Deckglas auf den Montagepuffer. Legen Sie die beiden Deckgläser mit dem ultradünnen Schnitt in eine Bildgebungskammer.

Lokalisieren Sie den Schnitt mit dem Ringmarker im Hellfeld-Bildgebungsmodus eines inversen Fluoreszenzmikroskops und bewegen Sie sich zu einer Ecke des Schnitts. Schalten Sie das weiße Licht ein und nehmen Sie das Hellfeldbild auf. Schalten Sie dann das weiße Licht aus.

Aktivieren Sie den Laser und nehmen Sie fluoreszierende Bilder desselben Sichtfelds auf. Deaktivieren Sie den Laser und bewegen Sie sich mit einer Überlappung von 10% in das benachbarte Sichtfeld. Erfassen Sie sowohl das Hellfeld- als auch das Fluoreszenzbild des zweiten Sichtfelds und zeichnen Sie den Bildgebungspfad zum Zusammenfügen des Sichtfelds auf.

Verwenden Sie nun die Navigationskarte, um die gewünschten Zellen anzuvisieren. Aktivieren Sie den Laser und nehmen Sie 300 Bilder mit fluoreszierenden Bildern der interessierenden Zelle auf. Deaktivieren Sie dann den Laser.

Aktivieren Sie anschließend das weiße Licht und nehmen Sie ca. 100 aufeinanderfolgende Hellfeldbilder auf. Um die Schnitte für die Elektronenmikroskopie vorzubereiten, füllen Sie ein Glas mit doppelt destilliertem Wasser. Entfernen Sie die Deckgläser mit den ultradünnen Abschnitten aus der Bildgebungskammer und trennen Sie sie mit einer Pinzette.

Klemmen Sie das Deckglas mit dem Abschnitt fest. Waschen Sie den Montagepuffer mit doppelt destilliertem Wasser ab und lassen Sie ihn trocknen. Mit einer einseitigen Klinge wird ein Hash um den ultradünnen Abschnitt erzielt.

Lassen Sie 10 Mikroliter 12%ige Flusssäure auf jede Ecke der Ritze fallen. Stellen Sie das Deckglas langsam ins Wasser. Schwimmen Sie dann die Pioloform-Folie und den ultradünnen Schnitt auf der Wasseroberfläche.

Platzieren Sie ein unbeschichtetes Schlitzraster auf dem Abschnitt, um es in der Rastermitte zu erfassen. Decken Sie einen Objektträger mit Paraform ab. Nehmen Sie das Gitter mit der Pioloform-Folie auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.