Sammeln Sie zunächst den Zebrafischembryo und ziehen Sie ihn bis 72 Stunden nach der Befruchtung in einem Inkubator bei 28,5 Grad Celsius auf. Bereiten Sie gleichzeitig die zu testenden Chemikalien in der gewünschten Konzentration vor. Untersuchen Sie die 72 Stunden nach der Befruchtung Embryonen.
Entfernen Sie tote oder nicht geschlüpfte Embryonen. Legen Sie 10 Embryonen in jede sechs Zentimeter große Gewebekulturschale mit neun Millilitern E3-Medium. Diese werden als Belichtungsplatten bezeichnet.
Beschriften Sie jede Expositionsplatte mit dem Namen der Verbindung, der Expositionskonzentration und der Replikatnummer. Geben Sie einen Milliliter Expositionslösung auf jede Platte, beginnend mit der niedrigsten Konzentration, und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Bei Verbindungen mit geringer Löslichkeit ersetzen Sie die gesamten 10 Milliliter des Mediums durch die Expositionslösung.
Notieren Sie die Reihenfolge, in der die zusammengesetzten Lösungen den Embryonen zugesetzt wurden, und inkubieren Sie die Platten dann 48 Stunden lang in der befeuchteten Kammer in einem Inkubator bei 28,5 Grad Celsius. Um den Vibrations-Schrecktest zu starten, schalten Sie den Computer und das Vibrationsgerät ein. Erstellen Sie eine Tabelle für die Konfigurationsdatei.
Fügen Sie Expositionsinformationen für jede der fünf Plattenpositionen hinzu und geben Sie Verbindung, Konzentration und Replikation an. Öffnen Sie die allgemeine Benutzeroberfläche oder das GUI-Programm für das Vibrations-Schock-Assay-Kit. Wählen Sie im GUI-Programm verschiedene Positionen aus, um die Kamerabewegung zu überprüfen und die Reaktion der Kamera zu beobachten.
Nehmen Sie die Probenplatte aus dem Inkubator. Platzieren Sie sie an den fünf vorgesehenen Positionen und lassen Sie die Embryonen einige Minuten ruhen. Klicken Sie im GUI-Programm auf Aufzeichnen und das neue Fenster wird angezeigt.
Wählen Sie in diesem Fenster die zuvor vorbereitete Konfigurationsdatei aus. Stellen Sie sicher, dass die Beispielbeschreibung mit den Stichproben an jeder Position übereinstimmt. Beobachten Sie, wie die LED aufleuchtet, wenn der Tonimpuls vom Programm aktiviert wird.
Nach der Aufnahme kehrt die Kamera in Position eins zurück und die Software beginnt mit der Komprimierung der Dateien. Ersetzen Sie die gemessenen Proben durch den nächsten Satz und fahren Sie mit dem nächsten Lauf wie gezeigt fort. Sammeln Sie dann die Expositionslösungen von allen gemessenen Platten und verwenden Sie ein Sieb, um gleichzeitig die Embryonen zurückzuhalten.
Um die Datenanalyse zu starten, öffnen Sie die Videodaten mit virtueller Synchronisation oder einer anderen Anzeigesoftware. Bewerten Sie visuell die Anzahl der Embryonen, die auf den Schallimpuls reagieren. Notieren Sie den Namen der Verbindung, das Replikat, die Konzentration der Verbindung und den Prozentsatz der beweglichen Embryonen in der Tabelle.
Führen Sie die Benchmark-Konzentrationsanalyse mit einem KNIME-Workflow mit eingebetteten R-Skripten durch. Eine Bewertung der Unbeweglichkeit in unbehandelten Wildtyp-Embryonen ergab eine durchschnittliche Unbeweglichkeit von 14,33 %, wenn sie einem Vibrationsreiz ausgesetzt wurden, mit Variationen zwischen verschiedenen Gelege. Die Benchmark-Konzentrationsberechnungen für Tricain-Effekte auf die Motilität zeigten eine Verringerung der Motilität bei einer Konzentration von 1 %, wobei die Aktivität über 2,5 % mit einer Benchmark-Konzentration 50 von 164,9 Mikromolaren aufhörte.
Ein suboptimales Assay-Beispiel zeigte Inkonsistenzen in den Embryonenreaktionen, was auf Entwicklungsprobleme hindeutet, die die Robustheit der Schreckreaktion beeinträchtigen.
