Bereiten Sie zunächst eine Kollagen-IV-Lösung von einem Milligramm pro Milliliter in Wasser vor und geben Sie 95 Mikroliter dieser Lösung in jede Vertiefung eines 10-Well-Objektträgers der unteren Bildgebungskammer. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bis zwei Stunden, um die Vertiefungen zu beschichten. Aus den kultivierten 3D-Organoiden des menschlichen Darms wird das WRNE-Erhaltungsmedium fünf bis sieben Tage nach der letzten Passage aus den Vertiefungen entfernt.
Dann fügen Sie 500 Mikroliter 1xPBS mit 0,5 Millimolar EDTA pro Vertiefung hinzu. Mit einer vorcodierten Ein-Milliliter-Spitze vorsichtig pipettieren, um BMM von der Platte zu lösen. Die Suspension wird in ein vorcodiertes konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Spülen Sie jede Vertiefung mit weiteren 500 Mikrolitern der PBS-EDTA-Lösung. Zentrifugieren Sie die Suspension und entfernen Sie den Überstand und die BMM-Reste. Verwenden Sie dann eine vorcodierte Spitze, um das Pellet in drei Milliliter PBS mit fünf Millimolar EDTA zu resuspendieren.
Erneut zentrifugieren und in zwei Millilitern enzymatischem Dissoziationspuffer resuspendieren. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann drei Milliliter CMGF-with 10%FBS hinzu und mischen Sie vorsichtig.
Zentrifugieren und einen Milliliter CMGF- in das Pellet geben. Pipettieren Sie die Mischung 80 bis 100 Mal kräftig, um die Organoide in einzelne Zellen zu zerlegen. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter WRNE-Medium.
Ermitteln Sie eine Zellzahl und verdünnen Sie die Zellsuspension, um 1,25 mal 10 auf die fünf Zellen in 100 Mikrolitern zu erreichen. Entfernen Sie als Nächstes die Kollagenlösung von der zuvor vorbereiteten Platte und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung zu berühren. Geben Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten Zelllösung pro Vertiefung hinzu.
24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie das Medium alle 24 Stunden bis zur Konfluenz durch 100 Milliliter Differenzierungsmedium pro Well. Danach sind die Monolayer bereit für Downstream-Anwendungen.
