Richten Sie zunächst das Epifluoreszenzmikroskop ein. Vor der Bildgebung wird der Stage Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius vorgeheizt und befeuchtetes Kohlendioxid mit 0,02 Litern pro Minute in der Kammer betrieben. Legen Sie dann den Objektträger mit infizierten Monolayern in die Inkubatorkammer und verschließen Sie den Deckel.
Wählen Sie mit einem 20X-Objektiv bei Hellfeldbeleuchtung die X- und Y-Koordinaten der Sichtfelder innerhalb der Monoschicht aus. Optimieren Sie die Bildgebungsparameter und nehmen Sie ein Bild mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern auf. Um die Phototoxizität zu minimieren, stellen Sie die Lichtquelle auf 50 % Leistung mit einer Belichtungszeit von 50 Millisekunden ein.
Stellen Sie sicher, dass keine Pixel gesättigt sind, und stellen Sie die Einstellung so ein, dass der gesamte Dynamikbereich des fluoreszierenden Kalziumsensors erkannt wird. Richten Sie eine Imaging-Schleife ein und erfassen Sie ein Bild an jeder ausgewählten X- und Y-Koordinate in einer einminütigen Schleife und ein Bild in dieser Schleife kontinuierlich. Bei fluoreszenzmarkierten Viren ist bei jeder 10. Schleife ein Bild auf dem entsprechenden Kanal aufzunehmen.
Wenn Sie nicht-fluoreszierende Viren verwenden, führen Sie nach der Bildgebung eine Aminofluoreszenzfärbung durch. Fixieren Sie zunächst die Monolagen mit 100 Mikrolitern Formaldehyd. Nach der Inkubation wird das Fixiermittel entfernt und mit 100 Mikrolitern 50 Millimolar-Ammoniumchlorid 10 Minuten lang abgeschreckt.
Nach dem Entfernen von Ammoniumchlorid permeabilisieren Sie die Monolagen mit 100 Mikrolitern 0,1%Triton X-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann entfernen Sie die Lösung, fügen Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang. Entfernen Sie dann die blockierende Lösung und fügen Sie 100 Mikroliter Primärantikörper hinzu, die in 1X PBS getäuscht wurden.
Über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln inkubieren. Nach der Inkubation die Primärantikörper entfernen und dreimal mit 1X PBS waschen. Zum Schluss werden 100 Mikroliter fluoreszierende konjugierte Sekundärantikörper zugegeben, die in 1X PBS getäuscht wurden.
Um ein Ausbleichen zu verhindern, schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Sekundäre Antikörper nach der Inkubation entfernen und die Proben mit DAPI-Lösung färben. Platzieren Sie dann die fixierten Monoschichten für die Bildgebung in 100 Mikroliter 1X PBS.
Legen Sie den Objektträger wieder auf den Mikroskoptisch. Laden Sie die X- und Y-Koordinaten aus dem Live-Imaging-Lauf neu und bilden Sie jeden Multi-Point auf dem Kanal ab, der dem für die Färbung verwendeten Sekundärantikörper entspricht. Verweisen Sie auf die Bilder aus dem Live-Imaging-Lauf, um sicherzustellen, dass dieselben Punkte erfasst werden.
Mit dieser Technik wurde die Rotavirusinfektion in einem hIO-Monolayer abgebildet, nachdem dieser Monolayer geritzt wurde. Für rekombinante Rotavirenstämme, die fluoreszierende Proteine exprimieren, wie z. B. mRuby, wurde die Infektion während der Live-Bildgebung nachgewiesen. Wenn hingegen ein Stamm verwendet wurde, der keinen Marker exprimiert, wurde die Infektion nach der Bildgebung durch Immunfluoreszenz nachgewiesen.
