Geben Sie zunächst einen Milliliter 1% extrazelluläre Matrix in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre. Nach einer Stunde zwei Milliliter vorwarmes Erhaltungsmedium mit 0,4 mikromolaren Y-27632 in jede Vertiefung geben.
Um die embryonalen H9-Stammzellen aufzutauen, schütteln Sie den Kryoröhrchenfond in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden. Sterilisieren Sie das Kryofläschchen vorsichtig mit einem 75%igen Desinfektionsalkoholspray. Übertragen Sie dann die aufgetauten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das das Erhaltungsmedium und Y-27632 enthält.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 190 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann vorsichtig den größten Teil des Überstands und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Erhaltungsmedium, das Y-27632 enthält. Geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte, die das Erhaltungsmedium enthält.
Schütteln Sie die Platte seitlich und inkubieren Sie die Platte mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Sobald die Klondichte 70% erreicht hatEntfernen Sie das verbrauchte Medium.
Inkubieren Sie die Zellen nach 2D-PBS-Waschungen vier bis sieben Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter EDTA und entsorgen Sie EDTA vollständig. Geben Sie einen Milliliter Erhaltungsmedium in die Zellen und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte. Übertragen Sie dann die gelösten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie sie drei- bis fünfmal.
Geben Sie 20 bis 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer zuvor zubereiteten ECM-beschichteten Schale und mischen Sie sie gut. Bestätigen Sie mit einem Mikroskop die Zelldichte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.
