Zu Beginn werden H9-embryonale Stammzellen in Erhaltungsmedium aufgetaut und kultiviert, das Y-27632 enthält. Am Tag Null, sobald die Kolonien zu 70 % konfluierend sind, waschen Sie sie mit 2 Millilitern DPBS und inkubieren Sie die Zellen dann mit 0,5 Millilitern Zelldissoziationslösung mit 20 Mikromol pro Liter Y-27632. Um den Aufschluss abzubrechen, fügen Sie 3 Milliliter Erhaltungsmedium mit 20 Mikromol pro Liter Y-27632 hinzu.
Um die Zellen zu pelletieren, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 190 g und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter wachstumsfaktorfreiem, chemisch definiertem Medium mit Y-27632. Nach dem Zählen der Zellen 1,2 Millionen Zellen in 10 Milliliter wachstumsfaktorfreies, chemisch definiertes Medium geben und gut mischen.
Geben Sie dann 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer konischen 96-Well-Bodenplatte. Inkubieren Sie in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Um die Netzhautbildung am sechsten Tag zu induzieren, geben Sie BMP4-haltiges Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte und inkubieren Sie erneut.
Ersetzen Sie am neunten, 12. und 15. Tag die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Medium ohne BMP4. Am 18. Tag werden die gebildeten Embryoidkörper vorsichtig in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der natürlichen Ausfällung der Embryoidkörper wird der Überstand vorsichtig entfernt und mit dem Differenzierungsmedium der neuralen Netzhaut gespült.
Legen Sie dann die Embryoidkörper in eine Sechs-Well-Platte mit geringer Absorption und inkubieren Sie die Platte erneut. Am Tag 21 zeigten Brightfield-Bilder eine kontinuierliche neuroepitheliale Struktur in der neuronalen Netzhaut, die mit dieser Methode erzeugt wurde. Die Erfolgsrate bei der Netzhautinduktion war signifikant höher und die mit diesem Protokoll erzeugten Netzhautorganoide waren in Größe und Morphologie im Vergleich zu anderen Methoden ähnlich.
