Sterilisieren und sezieren Sie zunächst die entkernten Augen, die aus einer USDA-inspizierten Metzgerei stammen, um die Augenmuschel vorzubereiten. Legen Sie die Augenmuschel vorsichtig mit der Innenseite nach oben in die Petrischale, in der sich das Zellsieb befindet. Geben Sie gekühltes DPBS in die Augenmuschel und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand knapp unter dem tiefsten Punkt des Einschnitts liegt.
Suchen Sie unter einer Taschenlampe alle Bereiche, in denen sich die Neuralnetzhaut vom retinalen Pigmentepithel zu lösen beginnt, und verwenden Sie dann eine stumpfe Pinzette, um die angehobene Neuralnetzhaut vorsichtig zu greifen und abzuziehen. Sammeln Sie vorsichtig die neuronale Netzhaut in der Nähe der Papelle. Saugen Sie mit einer Weidepipette, die an einem Vakuumabsaugsystem befestigt ist, die neuronale Netzhaut ab.
Fügen Sie vorsichtig zusätzliches gekühltes DPBS hinzu, um das angesaugte Volumen zu ersetzen. Aspirieren Sie nun dieses hinzugefügte DPBS, um die verbleibende neuronale Netzhaut zu entfernen. Nachdem Sie die Neuralnetzhaut von allen Augenmuscheln entfernt haben, fügen Sie vorsichtig Trypsin zu jeder Augenmuschel hinzu und setzen Sie den Petrischalendeckel wieder auf.
Inkubieren Sie die Augen 30 Minuten lang mit Trypsin bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie unter einer Taschenlampe eine Tausend-Mikroliter-Pipette, um die retinalen Pigmentepithelzellen vorsichtig von jeder Augenmuschel zu entfernen. Übertragen Sie die gelösten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Waschen Sie die Augenmuschel mit Zellkulturmedien, um verbleibende Zellen zu sammeln und das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie diese medienhaltigen Zellen mit zuvor gesammelten Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in drei Millilitern Danase-Arbeitslösung. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 15 Minuten.
Dann zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 150 g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern frischem Zellkulturmedium. Übertragen Sie Zellen aus zwei bis drei Augen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und betrachten Sie dies als Durchgang Null.
Übertragen Sie dann die besiedelte Sechs-Well-Platte vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Primäre retinale Pigmentepithelzellen wurden aus Schweineaugen isoliert, wobei die charakteristische Pigmentierung drei Tage nach der Isolierung offensichtlich war. Die Zellen erreichten nach einer Woche eine vollständige Konfluenz, was auf eine gesunde Monoschicht hindeutet.
Kulturen mit abnormaler Morphologie und übermäßiger Pigmentierung wurden als kontaminiert erkannt und in den Experimenten nicht verwendet.
