Die Autoren danken Farhad Farjood für die Hilfe bei der RPE-Zellkultur und -isolierung von Schweinen und Thomas Harris für die Hilfe bei SEM. Die Autoren danken der Microscopy Core Facility an der Utah State University für die Unterstützung der REM-Analyse. Die Einrichtung unterhält ein Rasterelektronenmikroskop, das durch einen Zuschuss der National Science Foundation Major Research Instrumentation (CMMI-1337932) erworben wurde. Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch ein National Institutes of Health durch Grant 1R15EY028732 (Vargis) und ein BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Zusätzliche Mittel wurden durch einen Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) des Office of Research der Utah State University und einen Seed Grant (Vargis) des Alzheimer's Disease and Dementia Research Center der Utah State University bereitgestellt.

Die bei diesem Verfahren verwendeten Augen werden post mortem von einer lokalen, vom USDA inspizierten Metzgerei gewonnen, und es werden keine Arbeiten mit lebenden Tieren durchgeführt. Nach der Tötung der Tiere vergehen ca. 2 Stunden, bis die Augen entkernt sind. Da Gewebezerfall auftreten kann, ist es wichtig, die Augen während des Transports kühl zu halten, um weiteren Verfall zu verhindern. Bei diesem Verfahren werden die Augen nach der Enukleation sofort in einen Kühlschrank gelegt. Anschließend wird der Beutel in einem 1000-ml-Polypropylen-Becherglas positioniert und in einem 8-Liter-Kühler von Eis umgeben. Es ist wichtig, die Augen nicht direkt auf das Eis zu legen. Sobald die Augen im Labor ankommen, wird die Isolierung der RPE-Zellen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Es ist wichtig, diesen Vorgang innerhalb von 3-5 Stunden abzuschließen. Dieses Protokoll wurde für die Verarbeitung von 10 Augen optimiert.
1. Vorbereitung von DNase-Stammaliquoten
HINWEIS: Es wird empfohlen, diesen Schritt vor der Isolierung durchzuführen.
<ol><li>Bereiten Sie eine 5 mM Calciumchloridlösung mit sterilem deionisiertem Wasser vor. ACHTUNG: Calciumchloridpulver kann schwere Augenreizungen oder -schäden verursachen. Tragen Sie geeignete PSA.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mM Calciumchloridlösung zu DNase-Pulver hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige DNase-Konzentration von 3 mg/ml zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gründlich gemischt ist. ACHTUNG: DNase ist eine Gefahr für die Sensibilisierung der Atemwege. Pulver/Substanz nicht einatmen.</li>
	<li>Aliquotieren Sie kleine Volumina, z. B. 1 ml, in Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Aliquote bis zur Verwendung bei -20 °C einfrieren.</li>
</ol>2. Einrichten des Sezierbereichs
<ol><li>Übertragen Sie die sterilen Sezierinstrumente und Zellkulturgeräte in die Biosicherheitswerkbank: OP-Abdecktuch, Petrischale, Zellsiebe, Well-Platten, Gaze, Pinzette, Skalpellgriff, Skalpellklinge und Irisschere (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie das OP-Abdecktuch mit einer Pinzette aus. Legen Sie eine 6-Well-Platte auf das OP-Abdecktuch und entfernen Sie den Deckel.</li>
	<li>Legen Sie ein Aliquot der sterilen Dulbecco-Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und in die Biosicherheitswerkbank.</li>
	<li>Füllen Sie eine Mulde einer 6-Well-Platte zur Hälfte (ca. 6 ml) mit 10% iger Povidon-Jod-Lösung.</li>
	<li>Füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit gekühltem DPBS.</li>
	<li>Nehmen Sie den Deckel von einer der Petrischalen ab und legen Sie ihn umgedreht auf das OP-Tuch. Stellen Sie den Petrischalenboden als Abfallbehälter beiseite.</li>
	<li>Ein Aliquot von Zellkulturmedien (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fetales Kälberserum (FBS), 1% Antibiotika/Antimykotika) und ein Aliquot von 0,25% Trypsin/EDTA in ein 37 °C heißes Wasserbad geben.</li>
	<li>Nehmen Sie die DNase-Stammlösung aus dem Gefrierschrank (siehe Rest des Protokolls für weitere Details).</li>
</ol>3. Entfernung von äußerem Gewebe
HINWEIS: Die Entfernung von äußerem Gewebe kann außerhalb der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Untersuchen Sie das Auge vor dem Schneiden, um sicherzustellen, dass die Sklera nicht punktiert wurde, die Pupille nicht beschlagen ist und der Sehnerv vorhanden ist. Entsorgen Sie Augen, die diese Kriterien nicht erfüllen.
<ol><li>Während Sie den am Auge befestigten Muskel mit einer Hand halten, schneiden Sie mit der anderen Hand das Gewebe, das die Sklera umgibt, vorsichtig mit einem Skalpell ab. Achten Sie darauf, das Auge nicht zu zerquetschen oder versehentlich durch die Sklera zu schneiden. Wenn die Sklera durchtrennt ist und das schwarze Innere freilegt, entsorgen Sie das Auge. ACHTUNG: Ein schnittfester Handschuh wird dringend für die Hand empfohlen, die den Muskel hält, um sich vor versehentlichen Schnitten zu schützen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Sehnerv mit einer gebogenen Irisschere auf eine Länge von nicht mehr als 3 mm ab. Wenn der Sehnerv zu lang ist, sitzt die Augenmuschel später nicht richtig im Zellsieb.</li>
	<li>Legen Sie das Auge mit der Hornhaut nach unten auf Eis.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis das äußere Gewebe von jedem Auge entfernt ist.</li>
</ol>4. Augendissektion
<ol><li>Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Auge in die Biosicherheitswerkbank und in die Vertiefung mit 10% Povidon-Jod-Lösung zu übertragen, und drehen Sie das Auge, um sicherzustellen, dass es vollständig mit der Jodlösung beschichtet ist. Um die Werkzeuge so steril wie möglich zu halten, sollten diese Pinzetten nur zum Berühren der Außenseite des Auges verwendet werden.</li>
	<li>Während das Auge in Jodlösung sitzt, legen Sie eine sterile Gaze auf den flachen, umgekehrten Deckel der zuvor zubereiteten Petrischale. In eine separate Petrischale ein Zellsieb geben. Verwenden Sie das Zellsieb nur zur Unterstützung der Augenmuschel, nicht zur Zelltrennung.</li>
	<li>Nachdem Sie das Auge etwa 30 s lang in Jodlösung gelassen haben, waschen Sie das Auge, indem Sie es jeweils etwa 5 s lang in die Vertiefungen mit DPBS tauchen, von Vertiefung zu Vertiefung gehen, um die Jodlösung schrittweise zu verdünnen, und das Auge auf die sterile Gaze übertragen.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Skalpell unterhalb der Ora serrata oder etwa 1/3 des Globus vom Irisrand.</li>
	<li>Schneiden Sie nach dem Schnitt mit einer Irisschere gleichmäßig entlang des Umfangs des Globus, parallel zur Hornhaut. Verwenden Sie beim Manövrieren des Auges nur die Pinzette, um die Außenseite des Auges oder die Gaze zu berühren, um die Sterilität zu erhalten.</li>
	<li>Greifen Sie mit der Pinzette den Sehnerv und heben Sie die Kugel vorsichtig von der Gaze weg. Der Glaskörper sollte aus dem Globus fallen. Schütteln Sie bei Bedarf das Auge vorsichtig, um den Glaskörper zu lösen. HINWEIS: Wenn der Glaskörper sehr schwer zu entfernen ist, versuchen Sie, tiefer auf dem Globus zu schneiden.</li>
	<li>Legen Sie die Augenmuschel vorsichtig mit der Innenseite der Augenmuschel nach oben in das vorbereitete Zellsieb. Wenn Sie ungleichmäßig sind, verwenden Sie eine Pinzette, um die Augenmuschel so waagerecht wie möglich zu halten.</li>
	<li>Geben Sie abgekühltes DPBS vorsichtig in die Augenmuschel, sodass der Flüssigkeitsstand knapp unter dem tiefsten Punkt des Einschnitts liegt. Dieses DPBS wird nach der Entfernung der neuronalen Netzhaut entfernt. HINWEIS: Das Volumen des hinzugefügten DPBS variiert je nach Augengröße und Schnittstelle.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.8, bis alle Augen präpariert sind.</li>
</ol>5. Entfernung der neuronalen Netzhaut und RPE-Dissoziation
HINWEIS: Der folgende Abschnitt ist einfacher in Etappen durchzuführen. In diesem Setup wird dieser Prozess jeweils an einer Charge (normalerweise 3 Augenmuscheln) durchgeführt. Bei den Schritten 5.1 bis 5.7 sollte jeder Schritt für den gesamten Stapel ausgeführt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
<ol><li>Suchen Sie unter einer Taschenlampe alle Bereiche, in denen sich die neuronale Netzhaut (weiß/rosa) vom RPE (schwarz) zu lösen beginnt. Greifen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die angehobene neuronale Netzhaut und ziehen Sie sie ab. HINWEIS: Wenn es keine Bereiche gibt, in denen sich die neuronale Netzhaut ablöst, greifen Sie sie mit der Pinzette vorsichtig in der Nähe der Oberseite der Augenmuschel. Wenn bei dieser Methode das RPE/die Aderhaut beschädigt wird, werden diese Zellen während der RPE-Entnahme nicht dissoziiert.</li>
	<li>Sammeln Sie vorsichtig die neuronale Netzhaut in der Nähe der Papelle.</li>
	<li>Saugen Sie die neuronale Netzhaut mit einer Pasteur-Pipette ab, die an einem Vakuumabsaugsystem befestigt ist. Es wird empfohlen, die Aspiration zu federn, um den Entfernungsprozess zu unterstützen. HINWEIS: Eine Pipettenspitze kann auf das Ende einer Pasteurpipette gelegt werden, um die Saugkraft zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig zusätzliches gekühltes DPBS hinzu, um das Angesaugte zu ersetzen.</li>
	<li>Entfernen Sie die verbleibende neuronale Netzhaut, indem Sie erneut aspirieren. Entfernen Sie dieses Mal so viel DPBS wie möglich, ohne das freiliegende RPE zu stören.</li>
	<li>Geben Sie Trypsin vorsichtig in die Augenmuschel. Halten Sie den Volumenpegel unter der Inzisionslinie und allen Abschnitten beschädigter RPE, um Verunreinigungen zu reduzieren. ACHTUNG: Trypsin ist ein Enzym, das bei Kontakt Haut- und Augenreizungen verursacht. Tragen Sie geeignete PSA.</li>
	<li>Nachdem Trypsin in jedes Auge gegeben wurde, stellen Sie sicher, dass der Petrischalendeckel wieder aufgesetzt wird. Als nächstes wird die Petrischale 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator überführt.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7 für jede Charge, bis alle Augenmuscheln verarbeitet sind.</li>
</ol>6. RPE-Sammlung
<ol><li>Sammeln Sie die RPE-Zellen von jeder Augencharge (2-3 Augen) und geben Sie sie in ein einzelnes 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um den Aussaatprozess zu vereinfachen.<ol><li>Unter einer Taschenlampe vorsichtig mit einer 1000-μl-Pipette abreiben, um die RPE-Zellen zu entfernen. Wenn sich die RPE-Zellen nicht ablösen, fügen Sie frisches Trypsin hinzu und inkubieren Sie weitere 10-15 Minuten. Achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu kratzen.</li>
		<li>Sammeln Sie die RPE-Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Waschen Sie die Augenmuschel mit Zellkulturmedien, um verbleibende Zellen zu sammeln und das Trypsin zu neutralisieren. Stellen Sie sicher, dass sich mindestens das doppelte Volumen des Trypsin-Mediums im 15-ml-Zentrifugenröhrchen befindet.</li>
	</ol></li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 6.1, bis RPE-Zellen aus allen Augenmuscheln entnommen wurden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
</ol>7. Vorbereiten der DNase-Arbeitslösung
<ol><li>Berechnen Sie das Volumen von 3 mg/ml DNase-Stammlösung (hergestellt in Schritt 1), das für eine Endkonzentration von 100 μg/ml und ein Endvolumen von 3 ml pro Zellröhrchen zu Zellkulturmedien hinzugefügt werden muss (d. h. für drei Zentrifugenröhrchen mit Zellen sind 9 ml 100 μg/ml DNase-Lösung erforderlich).</li>
	<li>Kombinieren Sie die entsprechenden Volumina DNase-Stammlösung und Zellkulturmedien. Die Verwendung von DNase in der Arbeitslösung hilft, Zellverklumpungen zu verhindern und ermöglicht eine gleichmäßige Aussaat der Zellen.</li>
</ol>8. Aussaat von RPE-Zellen
<ol><li>Nach der Zentrifugation in Schritt 6.3 die Überstände von jedem 15-ml-Zentrifugenröhrchen entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass das Zellpellet nicht beschädigt wird.</li>
	<li>Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 3 ml DNase-Arbeitslösung.</li>
	<li>Die 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den resuspendierten Zellen werden 15 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator gegeben.</li>
	<li>Nach der Inkubation werden die Zellsuspensionen bei 150 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Überstände und achten Sie darauf, die Zellpellets nicht zu stören.</li>
	<li>Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 3 ml frischem Zellkulturmedium.</li>
	<li>Für jedes Zentrifugenröhrchen mit 2-3 Augen RPE-Zellen wird eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Durchgang 0) ausgesät.</li>
	<li>Übertragen Sie die besäte 6-Well-Platte vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
</ol>9. Primäre RPE-Zellkultur für Schweine
<ol><li>Lassen Sie die neu ausgesäten RPE-Zellen 48-72 h lang anhaften, bevor Sie die Platte bewegen. Während des ersten Medienwechsels kann eine Wäsche mit frischem Zellkulturmedium durchgeführt werden, um überschüssige Zelltrümmer zu entfernen.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Zellkulturmedium alle 48 h.</li>
	<li>Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, wechseln Sie zu einem Zellkulturmedium mit einer FBS-Konzentration von 2 % und halten Sie es bis zum Experimentieren aufrecht.</li>
</ol>10. Validierung von RPE-Zellen
<ol><li>Immunzytochemische (ICC) Färbung<ol><li>Fixieren Sie die Zellen in 4% Formaldehyd in DPBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zweimal mit DPBS waschen.</li>
		<li>Permeabilisieren Sie die Zellen (falls erforderlich) mit 0,2 % Triton-X 100 in DPBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zweimal mit DPBS waschen.</li>
		<li>Blockierende Lösung von 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS 1 h bei Raumtemperatur auftragen.</li>
		<li>Primärantikörper in einer Verdünnung von 1:100 (oder der empfohlenen Herstellerkonzentration) (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C ruhen lassen.</li>
		<li>Dreimal mit DPBS für jeweils 5 min waschen.</li>
		<li>Sekundärantikörper (falls erforderlich) mit 2 μg/ml (oder empfohlener Herstellerkonzentration) (siehe Materialtabelle) hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur ruhen lassen.</li>
		<li>Dreimal mit DPBS für jeweils 5 Minuten waschen, wenn ein sekundärer Antikörper angewendet wird.</li>
		<li>Fügen Sie eine Kernfärbesonde in der Konzentration des Herstellers hinzu (siehe Materialtabelle) und lassen Sie sie 25 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.</li>
		<li>Dreimal mit PBS waschen für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Wenn Sie sich auf einem Zellkultureinsatz befinden, montieren Sie ihn mit einem Deckglas unter Verwendung eines Eindeckmediums, wie von Rickabaugh und Weatherston et al.20 beschrieben. Andernfalls werden Bildzellen in DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Rasterelektronenmikroskopie (REM)<ol><li>Befolgen Sie das von Harris et al.21 beschriebene Verfahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER)<ol><li>Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für die TEER-Messung (siehe Materialtabelle) mit 1 ml Kulturmedium in der Basalkammer15.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)<ol><li>Führen Sie ELISA15 mit einem Multiplex-Assay-Kit für humane Enzyme gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>

Eine kostengünstige Methode zur Isolierung primärer RPE-Zellen aus Schweineaugen

<ol>
	<li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch's+membrane.">The dynamic nature of Bruch's membrane.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases.">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li><li>Georgiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+associated+signalling+proteins+ZO-1+and+ZONAB+regulate+retinal+pigment+epithelium+homeostasis+in+mice.">The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice.</a> PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease.">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Yang, S., Zhou, J., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).</li><li>Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE65+is+the+isomerohydrolase+in+the+retinoid+visual+cycle.">RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).</li><li>Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dual+roles+of+RPE65+S-palmitoylation+in+membrane+association+and+visual+cycle+function.">The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).</li><li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration:+A+review+of+major+disease+mechanisms.">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li><li>Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+barrier+breakdown+in+diabetic+retinopathy:+seeing+is+believing.">RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing.</a> Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).</li><li>Hellinen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+artificially+re-pigmented+ARPE-19+retinal+pigment+epithelial+cell+model.">Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).</li><li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line,+ARPE-19,+induced+by+nicotinamide.">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li><li>Samuel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriately+differentiated+ARPE-19+cells+regain+phenotype+and+gene+expression+profiles+similar+to+those+of+native+RPE+cells.">Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells.</a> Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).</li><li>Middleton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+ophthalmology.">Porcine ophthalmology.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).</li><li>Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+mechanical+stress+in+primary+porcine+RPE+cells+induces+angiogenic+factor+expression+and+in+vitro+angiogenesis.">Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).</li><li>Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+monolayer+to+complement+retinal+ex+vivo+cultures.">Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures.</a> STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).</li><li>Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts.">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).</li><li>Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+biomimetic+in+vitro+model+of+bruch's+membrane+using+hagfish+slime+intermediate+filament+proteins.">Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).</li><li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+recombinant+spider+silk+proteins+to+develop+a+synthetic+bruch's+membrane+for+modeling+the+retinal+pigment+epithelium.">Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).</li><li>Zou, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tight+junction+between+RPE+cells+with+tissue+factor+targeting+peptide.">Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide.</a> International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie RPE-Zellen aus Schweineaugen isoliert werden. Pigmentierung und Kopfsteinpflastermorphologie werden innerhalb von 7 Tagen nach der Isolierung beobachtet (Abbildung 1B). Darüber hinaus deuten die TEER-Daten auf eine Tight-Junction-Bildung22 und eine gesunde Monoschicht hin (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass mit dieser Methode isolierte RPE-Zellen dem menschlichen RPE ähneln und in Netzhautzellku...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht, die sich in der äußeren Netzhaut zwischen der Bruch-Membran und den Photorezeptorenbefindet 1. RPE-Zellen bilden Tight Junctions mit Proteinen wie Zonula occludens-1 (ZO-1) und besitzen einen charakteristischen Phänotyp, der durch Pigmentierung und hexagonale Morphologie gekennzeichnetist 2,3. Diese Zellen tragen zur Blut-Netzhaut-Schranke bei, wodurch die Gesundheit der Photorezeptoren unterstützt und die Netzhauthomöostase aufrechterhaltenwird 4,5. Darüber hinaus spielen RPE-Zellen eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie Licht absorbieren und wesentliche Komponenten für die Photorezeptoren recyceln6. Zum Beispiel wandelt RPE65, ein Protein, das in RPE-Zellen stark exprimiert wird, all-trans-Retinylester in 11-cis-Retinolum 7,8. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die von RPE-Zellen ausgeführt werden, ist ihre Funktionsstörung an verschiedenen Krankheiten beteiligt, darunter altersbedingte Makuladegeneration und diabetische Retinopathie 9,10. Um das Verständnis von Netzhauterkrankungen zu verbessern und neue Behandlungen zu entwickeln, werden häufig In-vitro-Modelle der Netzhaut eingesetzt.
Um repräsentative Modelle gesunder oder erkrankter Netzhäute zu generieren, ist es zwingend erforderlich, einen mimetischen RPE-Zelltyp zu verwenden. Der kommerziell erhältlichen ARPE-19-Zelllinie fehlen native Phänotypen, wie z. B. Pigmentierung, während die Differenzierung von iPSCs Monate dauern kann 11,12,13. Obwohl menschliche Spenderaugen ideal sein können, sind sie für viele Forschungslabors oft nicht ohne weiteres verfügbar.
Hier haben wir eine Methode entwickelt, um Schweineaugen, die viele Ähnlichkeiten mit menschlichen Augen14 aufweisen, zur Gewinnung primärer RPE-Zellen zu verwenden. Diese primären porcinen RPE-Zellen wurden in mehreren Netzhautmodellen verwendet15,16. Diese Zellen sind nicht nur kostengünstig, sondern benötigen auch weniger Zeit für die Gewinnung als iPSCs oder Spenderaugen. Darüber hinaus weisen sie native Merkmale wie Pigmentierung und Mikrovilli auf. Während ähnliche Protokolle für die RPE-Extraktion von Schweinen existieren 17,18,19, validiert diese einfache und detaillierte Technik die enzymatische Dissoziation weiter und verwendet Materialien, die in den meisten Zellkulturlabors üblich sind.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13191.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td>one per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler, 8 L</td>
			<td>Igloo</td>
			<td>32529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-200-154</td>
			<td>Culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Resistant Glove</td>
			<td>Dowellife</td>
			<td>712971375857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HyClone Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SH3026401</td>
			<td>for ICC dilutions only&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from Bovine Pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified - calcium - magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3002B.02</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)&#160;</td>
			<td>Quansys Biosciences, Logan, UT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDOHM 6 TEER device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>232B20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>LC146501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-415-504</td>
			<td>One per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32728</td>
			<td>RPE65 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Crushed prefered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5&#34;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-10818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-822-379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-710 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 mm x 20 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iondine Solution, 10%</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-050-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA116578</td>
			<td>RPE65 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades Size 10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-079-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handles Style 3</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-118-4164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drape, 18 x 26&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-209-1792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2, 95% Humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 6 Wells</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>One for eye wash and one for seeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 20A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 2A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-238-47</td>
			<td>for removing neural retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 5-SA-PI</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspiration System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>33-911-1</td>
			<td>ZO-1 conjugated primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary porcine retinal pigment epithelial cells for in vitro modeling

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine entscheidende Monoschicht in der äußeren Netzhaut, die für die Unterstützung von Photorezeptoren verantwortlich ist. RPE-Degeneration tritt häufig bei Krankheiten auf, die durch fortschreitenden Sehverlust gekennzeichnet sind, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Die Forschung zu AMD stützt sich oft auf menschliche Spenderaugen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), um das RPE darzustellen. Diese RPE-Quellen erfordern jedoch längere Differenzierungszeiträume und erhebliches Fachwissen für die Kultivierung. Darüber hinaus haben einige Forschungseinrichtungen, insbesondere in ländlichen Gebieten, keinen einfachen Zugang zu Spenderaugen. Es gibt zwar eine kommerziell erhältliche immortalisierte RPE-Zelllinie (ARPE-19), aber ihr fehlen wesentliche In-vivo-RPE-Eigenschaften und sie wird in vielen ophthalmologischen Forschungspublikationen nicht allgemein akzeptiert. Es besteht ein dringender Bedarf, repräsentative primäre RPE-Zellen aus einer leichter verfügbaren und kostengünstigeren Quelle zu beziehen. Dieses Protokoll erläutert die Isolierung und Subkultur von primären RPE-Zellen, die post mortem aus Schweineaugen gewonnen werden und vor Ort von kommerziellen oder akademischen Lieferanten bezogen werden können. Dieses Protokoll erfordert gängige Materialien, die typischerweise in Gewebekulturlabors zu finden sind. Das Ergebnis ist eine primäre, differenzierte und kostengünstige Alternative zu iPSCs, menschlichen Spenderaugen und ARPE-19-Zellen.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer located in the outer retina&#160;between Bruch&#39;s membrane and the photoreceptors1. RPE cells form tight junctions with proteins such as zonula occludens-1 (ZO-1) and possess a distinctive phenotype characterized by pigmentation and hexagonal morphology2,3. These cells contribute to the blood-retinal barrier, thereby supporting photoreceptor health and maintaining retinal homeostasis4,5. Additionally, RPE cells play a critical role in vision by absorbing light and recycling essential components for the photoreceptors6. For instance, RPE65, a protein highly expressed in RPE cells, converts all-trans retinyl esters to 11-cis retinol7,8. Given the multitude of functions performed by RPE cells, their dysfunction is implicated in various diseases, including age-related macular degeneration and diabetic retinopathy9,10. To enhance the understanding of retinal pathologies and develop new treatments, in vitro models of the retina are frequently employed.
To generate representative models of healthy or diseased retinas, it is imperative to use a mimetic RPE cell type. The commercially available ARPE-19 cell line lacks native phenotypes, such as pigmentation, while iPSCs can take months to differentiate11,12,13. Although human donor eyes may be ideal, they are often not readily available to many research labs.
Here, we have devised a method to utilize porcine eyes, which share many similarities with human eyes14, for obtaining primary RPE cells. These primary porcine RPE cells have been utilized in multiple retinal models15,16. Not only are these cells cost-effective, but they also require less time to acquire than iPSCs or donor eyes. Additionally, they exhibit native characteristics, such as pigmentation and microvilli. While similar protocols for porcine RPE extraction exist17,18,19, this straightforward and detailed technique further validates enzymatic dissociation and employs materials commonly found in most cell culture laboratories.

Autor im Rampenlicht: Modellierung von Netzhautpathologien mit verbesserten RPE-Zell-basierten Krankheitsmodellen

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

We engineer disease models to mimic aspects of retinal pathologies. With these models, we can better understand the role of RPE cells in diseases based on their response to physical changes, like when strain occurs on the monolayer or a brex membrane thickens with age. One of the biggest challenges is having a representative cell type.Compared to the commonly used immortalized cell line, the primary cells isolated with this technique make our disease models more realistic to what happens in our eyes. This technique provides us with a method of obtaining high quality cells without requiring extensive differentiation times. Furthermore, we use resources that are commonly available to research labs, which makes it more cost effective.Moving forward, we want to look at how natural changes that happen in your eyes during aging, may lead to the early stages of AMD. We want to better understand those changes so we can identify specific treatment targets.

Mit diesem Verfahren konnten primäre RPE-Zellen erfolgreich aus Schweineaugen isoliert werden. Abbildung 1A zeigt RPE-Zellen 3 Tage nach der Isolierung mit charakteristischer Pigmentierung. Nach 1 Woche Wachstum waren die Zellen vollständig konfluent und bildeten eine gesunde Monoschicht (Abbildung 1B). Die Zellen wurden dann in Zellkultureinsätze überführt, wo sie ihre Pigmentierung und Morphologie beibehielten (Abbildung 1C),...

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Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly ...

Wir entwickeln Krankheitsmodelle, um Aspekte von Netzhauterkrankungen nachzuahmen. Mit diesen Modellen können wir die Rolle von RPE-Zellen bei Krankheiten besser verstehen, basierend auf ihrer Reaktion auf physikalische Veränderungen, z. B. wenn die Monoschicht belastet wird oder eine Brexmembran mit zunehmendem Alter dicker wird. Eine der größten Herausforderungen ist es, einen repräsentativen Zelltyp zu haben.Im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten immortalisierten Zelllinie machen die mit dieser Technik isolierten Primärzellen unsere Krankheitsmodelle realistischer für das, was in unseren Augen passiert. Diese Technik bietet uns eine Methode, um qualitativ hochwertige Zellen zu erhalten, ohne dass umfangreiche Differenzierungszeiten erforderlich sind. Darüber hinaus verwenden wir Ressourcen, die Forschungslabors allgemein zur Verfügung stehen, was es kostengünstiger macht.In Zukunft wollen wir untersuchen, wie natürliche Veränderungen, die während des Alterns in Ihren Augen auftreten, zu den frühen Stadien der AMD führen können. Wir wollen diese Veränderungen besser verstehen, damit wir spezifische Behandlungsziele identifizieren können.

isolation-primary-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

557 Aufrufe.  Utah State University. Wir entwickeln Krankheitsmodelle, um Aspekte von Netzhauterkrankungen nachzuahmen. Mit diesen Modellen können wir die Rolle von RPE-Zellen bei Krankheiten besser verstehen, basierend auf ihrer Reaktion auf physikalische Veränderungen, z. B. wenn die Monoschicht belastet wird oder eine Brexmembran mit zunehmendem Alter dicker wird. Eine der größten Herausforderungen ist es, einen repräsentativen Zelltyp zu haben.Im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten immortalisierten Zellli...

Serie: Autor im Rampenlicht: Modellierung von Netzhautpathologien mit verbesserten RPE-Zell-basierten Krankheitsmodellen

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly occurs in diseases marked by progressive vision loss, such as age-related macular degeneration (AMD). Research on AMD often relies on human donor eyes or induced pluripotent stem cells (iPSCs) to represent the RPE. However, these RPE sources require extended differentiation periods and substantial expertise for culturing. Additionally, some research institutions, particularly those in rural areas, lack easy access to donor eyes. While a commercially available immortalized RPE cell line (ARPE-19) exists, it lacks essential in vivo RPE features and is not widely accepted in many ophthalmology research publications. There is a pressing need to obtain representative primary RPE cells from a more readily available and cost-effective source. This protocol elucidates the isolation and subculture of primary RPE cells obtained post-mortem from porcine eyes, which can be sourced locally from commercial or academic suppliers. This protocol necessitates common materials typically found in tissue culture labs. The result is a primary, differentiated, and cost-effective alternative to iPSCs, human donor eyes, and ARPE-19 cells.

This protocol outlines the procedure for obtaining and culturing primary retinal pigment epithelial (RPE) cells from locally sourced porcine eyes. These cells serve as a high-quality alternative to stem cells and are suitable for in vitro retinal research.