Nehmen Sie zunächst Calu6-Zellen, die mit Fluorophor-konjugierter EV-microRNA und Zell-microRNA transfiziert wurden. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikrometer-Siebkappe, die im Lieferumfang der FACS-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden enthalten ist. Stellen Sie dann das Durchflusszytometriegerät auf, schalten Sie das Durchflusszytometer ein und lassen Sie es vor dem Gebrauch 30 Minuten lang aufwärmen.
Grundieren Sie das fluidische System mit Mantelflüssigkeit. Überprüfen und justieren Sie anschließend die Laserausrichtung. Zur Qualitätskontrolle wird hochreines gefiltertes Wasser in das Durchflusszytometer geladen und mit einer geeigneten Durchflussrate betrieben, um eine angemessene Erfassungszeit zu gewährleisten.
Stellen Sie dann den Schwellenwert für die Erfassung des Signals von Calu6-Zellen auf FSC 5.000 ein. Um die spektrale Überlappung zwischen den Fluorophoren zu berücksichtigen, werden Kompensationskontrollen mit nicht transfizierten Zellen und Zellen, die mit nur einem Fluorophor transfiziert wurden, hergestellt. Führen Sie eine Expressionsanalyse in transfizierten Zellen durch, indem Sie die FSC-, SSC-, FITC- und PE-Kanäle verwenden, die auf die Spannungseinheiten 258, 192, 269 bzw. 423 eingestellt sind.
Anschließend wird die negative Kontrollprobe in das Durchflusszytometer eingeführt. Erfassen Sie Zellsignale, nachdem Sie FSC- und SSC-Intensitäten in einem benutzerdefinierten Arbeitsblatt definiert haben. Wählen Sie FSC für die X-Achse und SSC für die Y-Achse im Diagramm aus.
Zeichnen Sie ein Polygon um die gewünschte Grundgesamtheit, um ein Tor auf der Achse zu erstellen. Um ein neues Diagramm mit der abgegrenzten Population zu erstellen, stellen Sie die X-Achse auf Fluoreszenzsignal 1 ein. Für die Zell-microRNA-Detektion und die Y-Achse zum Fluoreszenzsignal 2 für die EV-microRNA-Detektion.
Festlegung von Kompensationsparametern für die einzelnen Fluorophore unter Verwendung von Zellen, die unabhängig voneinander mit jeder der fluoreszenzmarkierten microRNAs transfiziert wurden. Die durchflusszytometrische Analyse von Zellen, die mit Zell-microRNA und EV-microRNA transfiziert wurden, ergab eine sequentielle Abnahme des Fluoreszenzsignals, das der EV-microRNA entspricht. Im Gegensatz dazu wurde das Signal, das der Zell-microRNA entspricht, in den Zellen zurückgehalten, was darauf hindeutet, dass der Fluorophor die Retention von microRNAs durch die Zellen nicht beeinflusst.
