Nehmen Sie zunächst EVs, die aus Calu6-Zellen isoliert und mit Fluorophor-konjugierter EV-Mikro-RNA und Zell-Mikro-RNA transfiziert werden. Verdünnen Sie die EVs in einem geeigneten Volumen ultrafiltrierten PBS, um die extrazelluläre Vesikelsuspension für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten. Verwenden Sie das Nano-Durchflusszytometer, um Partikel in Nanogröße zu analysieren.
Starten Sie die Software und konfigurieren Sie das Gerät gemäß den empfohlenen Kalibrierungsanweisungen. Führen Sie den Leistungstest unter Verwendung von Leistungs-Nanoperlen durch. Die Leistung des Instruments gilt als optimal, wenn die Nanoperlen innerhalb des Standardgrößenbereichs detektiert werden.
Bestimmen Sie die geeignete Durchflussrate für die EV-Partikeldetektion. Führen Sie nun eine Qualitätskontrolle mit hochreinem gefiltertem Wasser durch, um die Fluidik des Instruments zu überprüfen und die Leistung von Detektoren und Lasern zu bewerten. Konfigurieren Sie die Parameter, um die Empfindlichkeit und Auflösung verschiedener Populationen in der Perlenmischung gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bewerten.
Wenden Sie dann eine geeignete Anspritzung an, um die Perlenpopulation vom Instrumentenrauschen zu unterscheiden. Als Nächstes werden die Proben gründlich vorgewirbelt, um eine gleichmäßige Verteilung der Elektrofahrzeuge zu gewährleisten, bevor sie zur Analyse geladen werden. Starten Sie die Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie und führen Sie ultrafiltriertes PBS ein.
Richten Sie mithilfe von ultragefiltertem PBS ein Gating für EV-Partikel ein, um sicherzustellen, dass das Gating der entsprechenden Partikelgröße auf der Grundlage der Kalibrierung entspricht. Nehmen Sie EVs, die in eine abgestimmte kompatible Röhre übertragen und vortexed wurden, und laden Sie die Röhre in das Instrument. Erfassen Sie EV-Signale, während Sie FSC auf der x-Achse und SSC auf der y-Achse aufzeichnen.
Wählen Sie für die Zell-Mikro-RNA-Detektion auf der x-Achse das Fluoreszenzsignal 1 und für die EV-Mikro-RNA-Detektion auf der y-Achse das Fluoreszenzsignal 2. Unter Verwendung der EV-Proben, die aus Zellen isoliert wurden, die mit einer einzigen Mikro-RNA transfiziert wurden. Etablierte Kompensationsparameter für die Fluorophore.
Die Durchflusszytometrie ergab eine zeitabhängige Akkumulation von miR-451a, Alexa fluor-488 in Elektrofahrzeugen, was eine effiziente Verpackung und Freisetzung unterstützt. Im Gegensatz dazu wurde die Fluoreszenz der Zelle miR-67 in EVs nicht beobachtet.
