Um mit dem G/I-Tailing zu beginnen, bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Mischung auf Eis mit Gesamt-RNA, Tail-Puffer-Mix und Tail-Enzym-Mix vor. Bei 37 Grad Celsius 60 Minuten in einem Thermocycler inkubieren. Fügen Sie dann die Tail-Stop-Lösung hinzu und halten Sie sie zwei Minuten lang auf Eis.
Führen Sie eine reverse Transkription und PCR-Amplifikation durch. Nach der hochauflösenden Gelelektrophorese von PCR-Produkten greifen Sie mit der Software auf die Daten zu. Öffnen Sie die XAD-Datei und wählen Sie im Bedienfeld "Strukturansicht" Beispielnamen oder -kontaktplan aus.
Vergrößern und verkleinern Sie Elektropherogramme und gelartige Bilder für eine detaillierte Anzeige. Um die Peakgrößen zu erhalten, öffnen Sie das Elektropherogramm einer ausgewählten Probe. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm und wählen Sie Manuelle Integration, um Peaks manuell auszuwählen, indem Sie die horizontale Linie ziehen.
Beobachten Sie die Spitzenwerte in der Peak-Tabelle und identifizieren Sie den Peak mit der größten Peakhöhe. Aktivieren Sie das Symbol Sollwerte ein-/ausblenden im oberen Menü. Auf der rechten Seite wird ein neues Fenster angezeigt.
Wählen Sie Erweitert, scrollen Sie nach unten zu Abstrichanalyse durchführen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Dadurch wird die Tabelle Region zur Registerkarte Elektropherogramm hinzugefügt. Wählen Sie dann ein Elektropherogramm aus und gehen Sie zur Tabelle Region.
Legen Sie im Menü Von Basenpaar und Bis Basispaar das Start- und Endbasispaar fest, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm klicken und eine hinzuzufügende Region auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Zelle in der Tabelle Region und wählen Sie Regionen ändern, um ein kleines neues Fenster zum Festlegen benutzerdefinierter Regionen zu erstellen. Verwenden Sie diese Gleichung, um die Poly(A)schwanzlänge auf der interessierenden mRNA zu berechnen.
Aktivieren Sie als Nächstes auf der Registerkarte Elektropherogramm die Option Größen anzeigen, um die Tabelle Region automatisch vom Basispaar in die Laufzeit zu konvertieren. Öffnen Sie die CSV-Datei und wählen Sie die für die Laufzeit erhaltenen Werte aus, um ein Diagramm zu generieren. Mit diesem Protokoll wurden Poly(A)schwanzlängen von Dscam1- und GAPDH-Genen aus Drosophila-Larvengehirnen analysiert, während PCR-Produkte von genspezifischen Primerpaaren eine einzelne Bande zeigten.
PCR-Produkte aus den genspezifischen universellen Primerpaaren zeigten unterschiedliche Abstrichmuster, was auf eine unterschiedliche Poly(A)länge von mRNAs hinweist. Die durchschnittlichen Poly(A)schwanzlängen wurden mittels Abstrichanalyse ermittelt. Und der Bereich der Schwanzlängen wurde durch Elektropherogramme dargestellt.
In ähnlicher Weise zeigte die Poly(A)schwanzlängenanalyse an S2-Zellen unterschiedliche Poly(A)schwanzlängen für die SV43-Prime-UTR- und GAPDH-Gene.
