Nach der Transfektion der mPS-Zellen wird das Medium aus der Sechs-Well-Platte abgesaugt. Geben Sie dann 200 Mikroliter Trypsin in jede Vertiefung. 30 Sekunden bei 37 Grad Celsius schwenken und inkubieren.
Klopfen Sie auf die Seite der Platte und fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten FACS-Puffer hinzu. Mischen Sie mit einer P200-Pipette den Inhalt jeder Vertiefung, um Zellen zu entfernen und Einzelzelllösungen herzustellen. Übertragen Sie 200 Mikroliter aus jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung auf der 96-Well-Platte Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 300 g.
Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Pellets in 150 Mikrolitern FACS-Puffer, bevor Sie die Probe auf einem Durchflusszytometer durchführen. Im Vergleich zu umgekehrten Transfektionen zeigten Vorwärtstransektionen einen signifikant geringeren Anteil an Zellen, die positiv für den Marker waren. Interessanterweise lieferte Forward Transfect im Durchschnitt keine signifikant geringere Menge an DNA an die Zellpopulation.
Bei umgekehrten Querschnitten beeinflusste die Inkubationszeit signifikant den Prozentsatz der reporterpositiven Zellen. Die durchschnittliche Reporterexpression in positiven Zellen wurde jedoch nicht durch die Inkubationszeit beeinflusst. Sowohl bei der Poly- als auch bei der Co-Transfektion verringerte eine Vorwärtstransfektion die Anzahl der am gewählten Endpunkt vorhandenen Zellen im Vergleich zu umgekehrten Transfektionen signifikant.
Bei umgekehrten Polytransektionen wurden eine höhere Transfektionseffizienz und ein breiterer dynamischer Bereich gut repräsentierter DNA-Verhältnisse beobachtet.
