Zu Beginn züchten Sie das ausgewählte Hefetransformant in drei Millilitern SD URA-Medium bei 30 Grad Celsius, bis die Sättigung erreicht ist. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Zentrifugieren Sie zwei Milliliter der Nachtkultur bei 14.000 g bei Raumtemperatur.
Pipettieren Sie den Überstand heraus. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter MES-Puffer. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 14.000 g bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann den Überstand. Nachdem Sie die Zellen erneut mit MES-Puffer gewaschen haben, resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern MES-Puffer. Gießen Sie dann das gesamte Volumen in ein Reagenzreservoir.
Richten Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader ein. Navigieren Sie zum Symbol Protokoll verwalten und stellen Sie dann den Messtyp auf Fluoreszenzintensität und den Lesemodus auf Spektralscan ein. Geben Sie den Namen der Mikroplatte in GREINER 96 F BOTTOM ein und stellen Sie die untere Optik ein.
Greifen Sie auf die Optikeinstellungen zu, indem Sie Scan über Emission einstellen auswählen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 433 Nanometer mit einer Anregungsbandbreite von 10 Nanometern ein. Stellen Sie den Emissionswellenlängenbereich von 460 Nanometern bis 550 Nanometern mit einer Emissionsbandbreite von 10 Nanometern und einer Schrittweite von einem Nanometer ein.
Stellen Sie die Einstellzeit auf 0,1 Sekunden ein. Bereiten Sie nun unterschiedliche Konzentrationen der Natriumchloridlösung in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden vor. Laden Sie 150 Mikroliter MES-Puffer in die ersten drei Vertiefungen der Reihe A. Pipettieren Sie dann 150 Mikroliter der entsprechenden Osmolitlösung in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts.
Pipettieren Sie mit einer 12-Kanal-Mikropipette die gewaschene Hefesuspension mehrmals. Übertragen Sie dann 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung. Pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung mehrmals, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten.
Messen Sie sofort die Fluoreszenzintensitätsemissionsspektren. Beobachten Sie die Fluoreszenzemissionsspektren, die auf dem Bildschirm angezeigt werden. Die IDR-Konstrukte zeigten eine Kombination aus mCerulean3- und Citrin-Emissionsspektren.
Bei AtLEA45 verursachte hyperosmotischer Stress eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Akzeptierers mit verringerter Fluoreszenzintensität des Donors. Dies wurde im Albuminkonstrukt nicht beobachtet.
