Resuspendieren Sie zunächst das synthetisierte Peptid, das bei einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter in DMSO als Positivkontrolle wirkt. Mischen Sie das resuspendierte Peptid mit biotinyliertem Histon-H4-Peptid, um eine Standardkurve zu erstellen. Als nächstes stellen Sie die Acetylierungsreaktionen in doppelter Ausführung in 96-Well-PCR-Platten zusammen.
Eine 20-Mikroliter-Reaktion sollte 10 Mikroliter des Enzyms, einen Mikroliter H4-Peptid, einen Mikroliter 20X-Puffer und einen Mikroliter DTT umfassen. Geben Sie einen Mikroliter DMSO oder die Testverbindung in jede Vertiefung. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig, um sie zu mischen.
Dann inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis, um eine Enzyminhibitor-Komplexierung zu ermöglichen. Für die Fortsetzung der Acetylierungsreaktion kombinieren Sie zwei Mikroliter 4-Pentenöl-Coenzym A mit vier Mikrolitern Wasser. Geben Sie sechs Mikroliter dieser Mischung in die Vertiefungen.
Nach schonendem Mischen die Mischung bei 300 g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugieren. Inkubieren Sie den Inhalt eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in verschlossenen Röhrchen. Den Inhalt mit 20 Mikrolitern achtmolaren Harnstoff abschrecken und bis zur Weiterverarbeitung bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Als nächstes pipettieren Sie 80 Mikroliter PBST in jede Vertiefung der BSA-vorblockierten schwarzen NeutrAvidin-beschichteten 96-Well-Platten. Geben Sie 40 Mikroliter Reaktionsinhalt in die Vertiefungen der Platte. Pipettieren Sie dann die Standardkurvenpeptide in doppelter Ausführung in die verbleibenden Wells.
Rühren Sie die Peptide eine Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig auf einem Orbitalschüttler, um die Bindung zu erleichtern. Sobald die Bindung abgeschlossen ist, saugen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen an. Verwenden Sie eine Plattenwaschmaschine, um die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBST zu waschen.
Für die Click-Reaktion fügen Sie das THPTA-Kupfergemisch zu Natriumascorbat in Wasser und Biotinazid in DMSO hinzu. Geben Sie 19 Mikroliter der frisch gemischten Reagenzien in jede Vertiefung. Versiegeln Sie die Platte mit Alufolie.
Dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Saugen Sie die Lösung vor dem Waschen wie zuvor aus den Vertiefungen ab. Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter verdünnte Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Mischung in jede Vertiefung.
Eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Um die Amplex Red-Detektionsreagenzien zu kombinieren, pipettieren Sie 500 Mikroliter verdünntes Wasserstoffperoxid in das Amplex Red-Reagenz. Fügen Sie 50 Mikroliter dieser Mischung zu 4,5 Millilitern Natriumphosphat hinzu.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter des Amplex Red Reaktionsgemisches in die gewaschenen Wells. Dann die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Licht inkubieren. Starten Sie die SmartControl-Software und klicken Sie auf Plate Out.
Sobald die Platte in das Instrument übertragen wurde, klicken Sie auf das Amplex Red-Symbol und ändern Sie das Plattenlayout. Drücken Sie erneut auf das Amplex Red-Symbol, um das geänderte Layout anzuzeigen. Wählen Sie dann die oberen linken Standardwells aus dem Layout aus.
Ändern Sie den Dateinamen und drücken Sie dann auf Anpassung starten. Sobald die Verstärkung eingestellt ist, klicken Sie auf Messung starten. Drücken Sie Current State, um die Echtzeitmessung zu beobachten.
Schließen Sie nach Abschluss der Messung die Registerkarte. Klicken Sie dann im oberen Bereich auf Letzten Lauf öffnen. Navigieren Sie zur Registerkarte Mars.
Drücken Sie dann im Home-Menü auf Nach Excel exportieren, um die Datenergebnisse zu exportieren. Es wurde beobachtet, dass die Verbindungen A und C die HAT1-Aktivität für mehrere Verdünnungen um fast 100% hemmen.
