Um mit der Antigenbeschichtung zu beginnen, verdünnen Sie Ovalbumin mit einem Beschichtungspuffer auf fünf Mikrogramm pro Milliliter. Eine 96-Well-ELISA-Platte über Nacht bei vier Grad Celsius mit 100 Mikrolitern Ovalbuminlösung pro Well beschichten. Waschen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag fünfmal mit PBST.
Blockieren Sie die Vertiefungen mit 250 Mikrolitern 1%BSA PBST bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Um eine 1000-fache Serumverdünnung herzustellen, verdünnen Sie zunächst 20 Mikroliter Serum auf einen Milliliter mit 0,5 % BSA PBST. Entfernen Sie dann 25 Mikroliter Serumaliquot und verdünnen Sie es auf 500 Mikroliter mit 0,5 % BSA PBST.
Geben Sie 200 Mikroliter Serum, verdünnt auf das 1000-fache verdünnt, in die erste Reihe der beschichteten Platte. Geben Sie dann 100 Mikroliter 0,5 % BSA PBST in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Vertiefungen in der ersten Reihe. Übertragen Sie 100 Mikroliter von der ersten Reihe in die zweite Reihe und mischen Sie 10 Mal.
Um unterschiedliche Serumkonzentrationen für den IgG-Nachweis zu erzeugen, verwerfen Sie 100 Mikroliter Flüssigkeit aus der letzten Reihe. Verdünnen Sie anschließend die Vaginalspülung der Mäuse, die Bronchialveolenspülung, die Nasenspülflüssigkeit mit 0,5 % BSA PBST und die Dünndarmspülflüssigkeit mit 20 % fetalem Kälberserum-PBST. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie die Vertiefungen fünfmal mit PBST. Geben Sie 100 Mikroliter HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Vertiefungen fünfmal mit PBST gewaschen haben, fügen Sie 100 Mikroliter TMB ELISA-Substrat hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem lichtgeschützten Bereich.
Fügen Sie 100 Mikroliter 450-Nanometer-Stopplösung hinzu, um die Reaktion zu beenden. Messen Sie die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen Sie den Antikörpertiter, der einen positiven Ansprechwert als das 2,1-fache des Serumwerts der Kontrollmausgruppe definiert.
Der adjuvante Nanoemulsionsimpfstoff erhöhte signifikant die ovalbuminspezifischen IgG-, IgG1- und IgG2a-Antikörpertiter im Serum. Die spezifischen IgA-Spiegel in der Vaginalspülflüssigkeit und der Dünndarmspülflüssigkeit waren signifikant erhöht, wenn Ovalbumin mit kationischer Nanoemulsions-verkapselter Retinsäure adjuvantiert wurde.
