Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrie zur Messung der pHluorin2-Fluoreszenz in lebenden Trypanosoma brucei

Nehmen Sie zunächst pHluorin-exprimierende Trypanosoma brucei-Zellen ein. Fügen Sie Tetracyclin oder Doxycyclin hinzu und inkubieren Sie über Nacht, um die pHluorin-Expression zu induzieren. Dann drei Milliliter jeder Kultur in separate 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1000 xg. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS. Entfernen Sie nach dem vierten Zentrifugieren der Zellen den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen.

Fügen Sie entweder Propidiumiodid oder Thiazolrot hinzu, um tote von lebenden Zellen zu unterscheiden. Übertragen Sie dann jede Probe in fünf Milliliterröhrchen, die mit dem Durchflusszytometer kompatibel sind.