Starten Sie zunächst die Durchflusszytometer-Software. Öffnen Sie ein neues Experiment. Fügen Sie die gewünschte Anzahl von Proben hinzu und benennen Sie sie.
Richten Sie dann ein YL2-H- oder RL1-H-Kanalhistogramm, ein Punktdiagramm für Vorwärtsstreuflächen im Vergleich zu Seitenstreuflächen, ein Punktdiagramm für Vorwärtsstreuflächen im Vergleich zu Vorwärtsstreuhöhen und ein Punktdiagramm für BL1-H im Vergleich zu VL2-H ein. Setzen Sie die ungefärbten Wildtyp-Trypanosoma brucei-Kontrollzellen auf die Probeninjektionsöffnung und passen Sie die Tischposition an. Um die Dateigröße zu verringern, deaktivieren Sie die Kanäle, die nicht aufgezeichnet werden sollen.
Beginnen Sie mit einer niedrigen Durchflussrate, um Anpassungen zu ermöglichen. Klicken Sie dann auf Ausführen, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Feinabstimmung der YL2- oder RL1-Spannung, um den Hauptpeak innerhalb von 10 auf die dritte bis 10 auf die vierte relative Fluoreszenzintensitätseinheit auszurichten.
Passen Sie die Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen an, um sicherzustellen, dass mehr als 90 % der Ereignisse innerhalb des Punktdiagrammbereichs liegen. Legen Sie den Schwellenwert für die Vorwärtsstreuung fest, um Ablagerungen auszuschließen, ohne lebensfähige Zellen auszulassen. Ändern Sie die Kanaleinstellungen für VL 2 und BL 1, um den primären Peak der ungefärbten Wildtyp-Kontrolle innerhalb von 10 bis zwei bis 10 bis zur vierten relativen Fluoreszenzintensitätseinheit zu positionieren.
Klicken Sie auf Aufzeichnen und messen Sie mindestens 10.000 Ereignisse. Geben Sie dann die erste induzierte pHluorin-exprimierende Trypanosoma-Probe, die entweder mit Propidiumiodid oder Thiazolrot gefärbt ist, auf die Probeninjektionsöffnung. Starten Sie die Datenerfassung nach der Spülung erneut mit einer niedrigen Durchflussrate.
Überwachen Sie jedes Diagramm, um sicherzustellen, dass mehr als 90 % der Ereignisse korrekt erfasst werden und dass die VL2-H- und BL1-H-Kanäle nicht gesättigt sind. Speichern Sie die Daten jeder Probe im FCS-Dateiformat und bereiten Sie sie für die Analyse vor.
