Isolierung von Einzelzellen aus Organoiden des menschlichen Gehirns für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Sammeln Sie zu Beginn bis zu fünf menschliche Gehirnorganoide, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt wurden, in einer Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen. Überschüssiges Kulturmedium aspirieren und die Organoide einmal mit PBS waschen. Mit einem Skalpell die Organoide gründlich zerkleinern.

Fügen Sie den gehackten Organoiden eine Enzymmischung hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid bei 90 U/min für 10 bis 15 Minuten. Mischen Sie die Organoid-Suspension mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze. Fügen Sie dann die zweite Enzymmischung hinzu und inkubieren Sie sie 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Dissoziation, indem Sie 10 Milliliter Stopplösung hinzufügen. Filtrieren Sie die Zellsuspension auf einem 70-Mikron-Zellsieb. Die gefilterte Zellsuspension wird bei 300 g 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern kaltem 0,04 % BSA. Filtrieren Sie nun die Zellsuspension auf einem 40-Mikron-Zellsieb und zählen Sie die Zellen auf einem Zellzähler. Zentrifugieren Sie die erforderliche Menge an Zellsuspension, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in NSB plus Medium gemäß einem mikrofluidikbasierten scRNA-Seq-Kit-Handbuch.