Isolierung einzelner Zellkerne aus menschlichen Gehirnorganoiden für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Übertragen Sie zunächst vier menschliche Gehirnorganoide, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt wurden, in eine Sechs-Well-Platte mit gekühltem PBS. Jedes Organoid in vier Stücke schneiden. Schneiden Sie mit einer Schere die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und übertragen Sie damit Organoidstücke in einen Zwei-Milliliter-Douncer.

Aspirieren Sie PBS vollständig und fügen Sie einen Milliliter NP-40-Lysepuffer hinzu. Die Organoide dreimal mit dem Stößel A und dann mit dem Stößel B übergießen.Die Suspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Waschen Sie den Douncer mit einem Milliliter Lysepuffer und geben Sie die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen.

Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Organoidsuspension fünf Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand an, wobei 50 Mikroliter im Rohr verbleiben. Geben Sie einen Milliliter NSB Plus Medium in das Röhrchen.

Und nach fünf Minuten mischen, um das Pellet wieder zu suspendieren. Nachdem Sie einen Percoll-Gradienten in der Tube vorbereitet haben, schichten Sie die Organoid-Suspension darauf. Als nächstes zentrifugieren Sie die geschichtete Organoidsuspension bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in NSB Plus Medium. Filtrieren Sie die Kernlösung auf einem 40-Mikron-Zellsieb. Anschließend färben Sie die Zellkerne mit DAPI und zählen sie in einer Neubauer-Kammer.

Zentrifugieren Sie die erforderliche Menge an Kernlösung und resuspendieren Sie das Pellet in NSB Plus Medium gemäß einem mikrofluidikbasierten snRNA-seq-Kit-Handbuch.